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ClC-3氯离子通道在小梁细胞中作用的实验研究

尹元  
【摘要】: 原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma,POAG)是主要的不可逆性致盲眼病之一,其中高眼压是青光眼性视神经损伤的主要危险因素。大量研究表明,眼压升高的原因是房水外流阻力增高,其病理部位已锁定小梁网。而小梁细胞作为小梁网的内皮细胞,其形态、结构和功能的异常将引起房水外流受阻,导致POAG的发生和发展[1]。 POAG的主要病理变化包括小梁细胞数量、细胞间连接、细胞外基质的改变,以及小梁细胞的凋亡等。而有关离子通道,尤其是ClC(chloride channel)氯离子通道的研究表明,氯离子通道具有维持细胞的容积平衡、调节细胞电活动的功能,并且在细胞增殖、迁移、凋亡等多种生理、病理过程发挥重要作用[2-3],而这些作用与POAG的主要病理改变密切相关。氯离子通道广泛分布于哺乳动物的组织、器官和各种细胞中,目前已克隆出从ClC-1到ClC-7及ClC-ka、ClC-kb等九种ClC氯离子通道家族成员。通过RT-PCR已证实人小梁细胞表达ClC-2、ClC-3、ClC-5等多种氯离子通道[4];David指出氯离子通道在维持小梁细胞体积、调节房水外流易度、保持小梁细胞体内平衡等方面发挥重要作用[5]。 本研究以小梁细胞及氯离子通道家族的一个亚型ClC-3作为研究对象,探讨ClC-3氯离子通道在小梁细胞中的作用。首先应用RT-PCR及细胞免疫化学方法,检测ClC-3氯离子通道在永生株人眼小梁细胞中的表达。然后应用氯离子通道阻滞剂NPPB,通过MTT法、细胞周期同步化、5-FU诱导细胞凋亡、罗丹明123细胞线粒体膜电位(△Ψm)检测及建立小梁细胞吞噬乳胶株模型等方法,分别研究NPPB对小梁细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、线粒体膜电势及细胞吞噬功能的影响。由于氯离子通道阻滞剂NPPB对于多数氯离子通道均有阻断作用,对于ClC-3氯离子通道只具有相对特异性,因此我们采用反义寡核苷酸技术,特异性地抑制ClC-3氯离子通道蛋白在小梁细胞的表达,进而检测ClC-3氯离子通道在小梁细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、线粒体膜电势及细胞吞噬中的作用,从而为原发性开角型青光眼发病机制提供进一步的实验依据。


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