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重组人FGF-2的制备及活性研究

李洋  
【摘要】: 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor FGF-2)是1974年Gospodarwiz最早从牛脑垂体和脑组织中分离得到的,是FGF家族中最有代表性的成员,无糖基化位点,单链阳离子多肽,与肝素有较强的亲和力。存在于机体的各种组织中,具有广泛生物活性的肽类物质,对酸和热敏感,能刺激3T3成纤维细胞增殖,等电点为9.6。FGF-2有四种形式,以AUG为起始密码相对分子质量为18000。以CUG为起始密码相对分子质量分别为22000、22500和24000。以AUG为起始密码相对分子质量为18000的FGF-2是其主要活性形式,本文研究分子质量为18000的rhFGF-2,主要包括大规模发酵、纯化及生物分析,为rhFGF-2的工业化生产提供依据。基本过程是将实验室自制合成的FGF-2基因克隆到表达载体pPICZαC中,得到表达质粒pPICZαC-FGF-2。将pPICZαC-FGF-2表达质粒转化入毕赤酵母X-33中,建立具有原核系统良好操作性和真核系统后加工性的rhFGF-2毕赤酵母工程菌。通过PCR等鉴定筛选出高表达rhFGF-2的酵母菌株。确定最佳发酵条件后,在80 L发酵罐中进行大规模发酵表达,研究下游纯化条件并分析纯化产物活性。结果表明,毕赤酵母作为生物反应器大规模生产rhFGF-2,通过两步阳离子纯化可得到纯度达98%以上的rhFGF-2且有生物活性。 实验的创新之处在于:①建立利用巴斯德毕赤酵母真核系统,甲醇诱导能够分泌表达rhFGF-2,其表达具有累积效应,产量随表达时间延长而增加,24 h达到高峰;②建立大规模纯化rhFGF-2新方法;③rhFGF-2具有与天然FGF-2相似的生物学作用。


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