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重组人弹力素大规模发酵工艺的优化

牛超  
【摘要】: 弹力素(Elafin)是一种内源性、低分子量的弹性蛋白酶特异性抑制剂。它属于“trappin”蛋白家族,具有拮抗人白细胞弹性蛋白酶、成髓细胞蛋白酶和胰弹性蛋白酶的作用。在治疗各种因蛋白酶失衡而引起的急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合症和心肌炎等疾病方面具有很大的临床应用价值。 目前,弹力素主要是从银屑病患者的皮肤中提取。虽然在毕赤酵母中已经成功表达了重组人弹力素(recombinant human Elafin,rhElafin),但是由于其产量低,纯化工艺复杂等因素的影响,至今未见有利用毕赤酵母工业化生产rhElafin的报道。本课题对rhElafin的发酵工艺进行了优化,旨为rhElafin的大规模生产奠定基础。首先,通过电转化将编码成熟弹力素的基因转入毕赤酵母基因组中,经PCR鉴定及重组蛋白活力测定,筛选出高效、稳定表达rhElafin的毕赤酵母工程菌株;其次,进行rhElafin发酵系统的逐级放大研究,对发酵条件进行了优化,并摸索出最佳纯化方法;最后,对rhElafin的稳定性和活性情况进行了初步研究。 本课题的创新之处在于:采用逐级放大的方法对rhElafin的发酵工艺进行了优化,以提高目的蛋白的产量和纯度,从而为工业化生产rhElafin奠定基础。在80 L发酵罐中进行30 L发酵,rhElafin的表达水平是129 mg·L-1,经纯化后最终获得1.96 g rhElafin(纯度为95.14%,回收率为59.65%)。经猪胰弹性蛋白酶抑制试验发现rhElafin具有很好的酸碱稳定性和热稳定性;rhElafin对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的生长具有抑制作用。


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