辽宁省猪繁殖与呼吸综合征分子流行病学调查及免疫防制研究

【摘要】： 猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)在世界范围的广泛流行,给世界各国养猪业造成了巨大的经济损失,尤其是以美洲型变异毒株引起的高致病性蓝耳病(HP-PRRS)给我国养猪业造成了严重的损失和威胁。因此,当前迫切需要建立有效实用的PRRS诊断和防制技术。 本研究建立了特异敏感的能够区分高致病和经典株PRRSV的RT-PCR诊断方法,并对不同感染阶段PRRS病例进行病理形态学观察,总结PRRS典型的病理形态学特征,进而建立病理学和PCR相结合的PRRS综合诊断方法;调查了PRRSV在辽宁省的流行特征及其感染的宿主范围,在此基础上,分离PRRSV辽宁毒株,查明其基因类型及其遗传变异规律;构建PRRSV辽宁分离株ORF5核酸疫苗,并联合应用免疫增强剂进行动物免疫实验,从体液免疫和细胞免疫水平对所构建的核酸疫苗的免疫效果进行评价。 首先,本研究分别在HP-PRRSV和VR2332的Nsp2两端设计特异性引物,建立了能够区分高致病性和经典PRRSV毒株的RT-PCR诊断方法,经证实该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点。对不同感染阶段的PRRS病猪进行了病理形态学观察,建立了可对PRRS不同感染阶段作出诊断的病理学和PCR相结合的方法。 为了进一步调查辽宁省PRRSV的流行特征及其宿主范围,我们分别应用ELISA和RT-PCR方法对辽宁省不同类型、不同生长阶段的猪血清中PRRSV抗体和PRRSV的感染情况进行检测,结果表明,在辽宁省不同类型猪场和不同生长阶段猪群中均检出了PRRSV抗体和病原,其中抗体阳性率弱毒苗免疫猪场最高为79.8%;PRRSV阳性率发病猪场最高为81.6%;育肥猪抗体和病原阳性率均较高,分别为76.7%和31.3%;发病猪场和仔猪的PRRSV变异株检出比例最高,分别为93.4%和86.7%;此外,调查发现,PRRSV和链球菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、PCV2、CSFV和PRV等病原的混合感染严重,约占80%。综合分析结果表明,辽宁省存栏猪PRRSV血清抗体总阳性率为55.1%,PRRSV病原阳性率为19.5%。以上结果显示,辽宁省PRRS免疫保护率较低,病原分布较广,污染程度较为严重。同时,检出鸡、鸭、鸽、麻雀和羊的PRRSV血清抗体检测阳性,羊的PRRSV抗体阳性率高达27.5%。调查结果说明PRRSV可能还存在广泛的非猪宿主,因此在PRRS的防控过程中必须给予高度重视。 应用Marc-145细胞分离获得一美洲型PRRSV毒株,暂命名为PRRSV LN/0901,并从核苷酸和氨基酸水平上对该分离株的Nsp2和ORF5基因序列及推导的氨基酸序列进行同源性分析和遗传进化分析,结果表明,PRRSV LN/0901毒株与2006年以来国内的多数流行变异株的遗传关系较近,但形成一独立分支,这很可能是由于PRRSV在辽宁地区流行过程中出现了变异。此外,我们对PRRSV LN/0901毒株ORF5基因编码蛋白的疏水性及跨膜区预测分析,结果表明,其存在有3个疏水倾向性很高的区域,分别位于第8-28、63-78、110-128氨基酸处,在靠近N端的第15-32、66-88、103-125位氨基酸处存在有3个跨膜螺旋区;分析结果显示,该毒株的ORF5具有多个抗原优势表位,与国内同类毒株相比,既有共同抗原位点又有不同的抗原位点,因此该毒株的ORF5基因可作为开发研制辽宁地区PRRSV基因工程疫苗的重要候选基因。 在通过RT-PCR获得ORF5基因的基础上,成功构建了pCI-PRRSV LN/0901-ORF5真核表达质粒,通过脂质体将其转染Marc-145细胞,并通过RT-PCR、IFA及Western blotting方法从mRNA水平和蛋白水平证实了目的基因在体外细胞中的转录和表达,这将为我们进行后续动物免疫试验提供理论依据。之后,将制备纯化的疫苗质粒配合免疫增强剂免疫小鼠,并通过ELISA、MTT和流式细胞术等方法对疫苗质粒引起机体特异性的细胞免疫应答和体液免疫应答水平进行检测,结果表明,所构建的疫苗质粒能有效刺激小鼠抗PRRSV特异性抗体的产生和T淋巴细胞及其亚类的增殖;免疫增强剂转移因子和香菇多糖可显著增强核酸疫苗的免疫应答水平,联合应用免疫增强剂的免疫增强作用更加显著。 应用所构建的PRRSV核酸疫苗、PRRSV弱毒活疫苗、灭活疫苗等配合猪用转移因子、微生态制剂、香菇多糖等分别免疫仔猪,通过ELISA、MTT和流式细胞术等方法对各疫苗免疫组的免疫反应效果进行比较分析。结果表明,构建的核酸疫苗质粒能诱导免疫猪抗PRRSV特异性抗体的产生以及T淋巴细胞及其亚类的增殖,其体液和细胞免疫应答水平低于弱毒疫苗免疫组,与PRRSV灭活疫苗组差异不显著,但;此外,应用免疫增强剂能显著增加PRRSV核酸疫苗的免疫应答水平,且联合应用免疫增强剂较单一应用免疫增强剂效果显著。 总之,以上研究结果的取得将为辽宁省针对PRRS的综合诊断技术和有效防控措施的制定奠定理论基础。