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Beganatide对实验性糖尿病的治疗作用及机制研究

王雪云  
【摘要】: 糖尿病是一种进行性疾病,随病程延长,伴随出现多种代谢异常和血糖失控。调查显示,全世界每年有近10%的人受到糖尿病的威胁,其中,2型糖尿病(T2DM)患者占90%~95%。T2DM病程的主要特点为进行性胰岛素抵抗和β细胞功能减退,最终可导致心血管和微循环系统病变如视网膜病变、周围神经病变、动脉粥样硬化、心肌梗死、卒中、微血管并发症等。目前临床糖尿病的治疗主要以口服降糖药和胰岛素为主,虽然能够降低血糖,但却不能改善β细胞数量和功能的进行性下降,而且还能引发低血糖和增加体重。因此,仍然需要开发能够防止β细胞衰退而又不会使体重增加的新型降糖药物。 GLP-1是由肠道L细胞合成的30肽,通过刺激葡萄糖依赖的胰岛素分泌、胰岛素生物合成和抑制胰高糖素分泌而参与维持体内糖代谢平衡,因此,GLP-1是一个非常有前景的治疗糖尿病的药物。但是,天然GLP-1在体内可被DPP-IV迅速降解为无活性形式,因而半衰期很短。艾塞那肽为从毒蜥蜴的毒唾液中提取的39肽,较GLP-1具有较长的半衰期,临床应用每日给药2次。Beganatide结构与艾塞那肽类似,具有更强的活性作用,但血浆半衰期更长。 本研究中,采用改良固相合成法合成Beganatide,然后采用地塞米松诱导小鼠IR模型、四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠模型、STZ加高糖高脂饲养诱导大鼠T2MD模型及体外培养胰岛RINm5F细胞,评价Beganatide的生物活性,共分以下几部分进行: 第一部分,采用固相合成法合成了新型化合物Beganatide,并采用红外、质谱等方法对化合物基本结构进行了确证。结果表明,Beganatide的红外与质谱结果与预先设计的一致。 第二部分,以地塞米松诱导小鼠IR模型和四氧嘧啶诱导小鼠糖尿病模型观察Beganatide对小鼠血糖、胰岛素、糖耐量、血清TC、TG、FFA、MDA、SOD含量等的影响,并对胰腺组织进行醛复红染色、观察。结果,Beganatide明显改善IR小鼠的糖耐量异常,降低血清胰岛素水平(p0.01),同时还可以降低小鼠血清FFA、TG、TC含量(p0.05)。此外,Beganatide还可以降低糖尿病小鼠的空腹血糖(p0.05),增加胰岛素分泌(p0.05),降低血清中的MDA含量,升高SOD活性(p0.05),胰腺醛复红染色显示Beganatide可以明显减轻胰岛损伤。 第三部分,采用2次腹腔注射小剂量STZ(25mg·kg-1),加高糖高脂饲养造成类似人2型糖尿病的大鼠模型,每周一次观察大鼠体重、空腹血糖的变化。8周后对大鼠进行OGTT实验,并测定血清胰岛素、Hb1Ac、TC、TG、FFA、HDL含量的变化;最后采用病理形态学及免疫组织化学方法观i察胰腺的变化及胰岛素表达的变化。经Beganatide 8周的干预处理,大鼠的空腹血糖和Hb1Ac含量明显的下降(p0.05),OGTT实验显示大鼠糖耐量异常情况得到缓解,胰岛素敏感性增强。此外,对大鼠血清TC、TG、FFA含量也有明显降低,但HDL含量明显升高(p0.05),且可以控制体重的过分增长。病理检查和免疫组化结果也进一步显示,Beganatide组糖尿病大鼠胰岛的破坏程度明显减轻,胰岛素免疫阳性染色增加。 第四部分,采用体外培养大鼠胰岛瘤RINm5F细胞,观察Beganatide对其增殖及功能的影响。首先,采用MTT法观察Beganatide对正常细胞增殖的影响,并观察Beganatide对细胞胰岛素分泌的影响及不同葡萄糖浓度下Beganatide刺激胰岛素分泌的作用。其次,采用高FFA和高浓度葡萄糖诱导RINm5F细胞凋亡,观察对凋亡细胞存活的影响。最后,采用RT-PCR、Real-time PCR、Western-blot等方法观察Beganatide对细胞Bcl-2、Bax、Sirt1等表达的影响。结果,Beganatide可促进RINm5F细胞增殖,且可提高胰岛β细胞分泌胰岛素,使胰岛素刺激指数明显升高。Beganatide可以抑制棕榈酸和葡萄糖诱导的细胞凋亡增加细胞的存活率。Beganatide还可以增加凋亡细胞Bcl-2表达(较凋亡模型组升高1.57倍),抑制Bax表达(较模型组约下降1倍),使两者比值趋于正常。此外,诱导凋亡的RINm5F细胞Sirt1表达量明显下降(较凋亡模型组升高1.8倍),Beganatide可以提高凋亡细胞Sirt1基因的表达,增加Sirt1蛋白的表达量。 综上所述,通过以上实验可以得出以下结论: 1)改良固相合成法可以合成目标产物Beganatide,结构确证该物质与理论设计的一致。 2)Beganatide可减轻胰岛素抵抗小鼠的胰岛素抵抗症状,降低小鼠的血脂。 3)Beganatide具有降低血糖、抗氧化,对四氧嘧啶糖尿病小鼠的胰岛β细胞损伤具有明显的保护作用。 4)Beganatide对T2DM大鼠有明显的降血糖作用,对血脂也有明显改善作用,并能控制大鼠体重增加,减轻胰岛损伤。 5)Beganatide可促进RINm5F细胞增殖,抑制细胞凋亡并促进细胞胰岛素分泌。其作用机制与增加Bcl-2表达和下调Bax表达有关。 6)Sirt1基因表达与胰岛细胞凋亡有一定关系,调控Sirt1表达也是Beganatide发挥抗胰岛β细胞凋亡作用的可能途径。


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