探讨益肾健骨合剂在自体骨修复骨缺损中的干预效应及IGF-1基因表达

【摘要】：目的：探讨中药复方“益肾健骨合剂”在自体骨修复骨缺损中的干预效应及与IGF-1 (insulin-like growth factor-1, IGF-1)生长因子的表达关系。 方法：新西兰大耳白兔90只,雌雄不限,体重(2.0±0.5)kg。随机分为实验组、有效对照组和对照组各30只。分别于术后1、2、4、6、8周每组随机处死6只新西兰大耳白兔,取其桡骨原骨缺损植骨处生长组织检测。实验组、有效对照组与对照组均在氯胺酮30mg/kg肌注麻醉后,按无菌操作技术行左侧桡骨中上段截骨,造成15mm骨和骨膜缺损,两端髓腔用骨腊封闭,另取双侧自体髂骨制成2×2×2mm的粒状骨,于骨缺损处植入上述粒状骨。创口严密缝合,不做内、外固定,分笼喂养。术后实验组用含中药复方“益肾健骨合剂”的混合饲料喂养。“益肾健骨合剂”由鹿茸、淫羊藿、杜仲、水蛭、骨碎补、续断、自然铜、土鳖虫组成,是根据《中国药典》“跌打活血散”及东北长白山地区民间促骨愈合秘方组合加减配制而成。有效对照组用含伤科接骨片的饲料喂养。对照组用不含中药的普通饲料喂养。自由活动,术后肌肉注射庆大霉素3天,预防感染。分别在术后1、2、4、6、8周时行兔桡骨X-线检查,并取兔桡骨骨缺损处组织作为标本,进行HE染色、电镜、免疫组织化学、原位杂交、RT-PCR检测,具体观察和分析“益肾健骨合剂”在自体骨修复骨缺损中的干预效应及与胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的表达关系。 结果： (1)X线片检查：1周时实验组、有效对照组和对照组修复区均无明显差异变化,可以看到骨缺损处移植的小颗粒状骨影,界限清晰,无新生骨痂形成；2周时实验组及有效对照组开始有少量骨痂形成,骨缺损界限仍清晰,对照组骨吸收明显；4周时实验组及有效对照组均有片状骨痂形成,骨痂形成量较前明显增多。相对于实验组比较,有效对照组片状骨痂较少。而对照组有部分骨痂形成,缺损区骨质稀疏；6周时实验组骨缺损处骨痂生长连续,缺损区示模糊不清,可见大量增生的编织骨。有效对照组出现少量编织骨,但部分区域有骨吸收表现。而对照组骨缺损处虽有轻微模糊改变,但部分骨质出现硬化改变；8周时可见实验组及有效对照组骨缺损处形成大量骨痂,成弥漫性密度增高影,而且实验组骨缺损有部分骨髓腔形成。但对照组第8周时仍未有骨髓腔的再通迹象。对照组骨缺损修复区虽然同样形成骨痂,但是相比实验组、有效对照组而言,骨痂形成量少且生长不均匀。 (2)HE染色：实验组及有效对照组在第1周时移植骨内有部分骨细胞坏死、细胞核浓缩、甚至消失,移植骨内有成纤维细胞增生并伴有炎性细胞生成；2-4周时移植骨内有少量软骨细胞形成,同时实验组伴有大量血管生长,移植骨内细胞明显吸收并有核浓缩碎裂现象。有效对照组伴有较多血管生长,移植骨内有细胞吸收并也出现核浓缩碎裂现象；6-8周时移植骨区的血管数量增多,实验组有明显网状新骨生成,并伴有骨髓腔的形成,有效对照组可见网状新骨生成,并伴有少量骨髓腔的形成；对照组1周时移植区也有大量的炎性反应与实验组无明显变化；但是在2-4周后且伴有少量软骨细胞和血管形成,骨细胞进一步坏死。6-8周时移植骨区松质骨内组织结构继续溶解,受区部位骨组织开始长入。 (3)电镜观察：1周时,实验组、有效对照组和对照组均有部分骨小梁坏死状物,并伴有较多炎性细胞的产生；2周时,实验组可见细胞呈梭形,周围有少量纤维成分,骨细胞核浓缩,染色质凝聚靠边,有效对照组亦可见梭形细胞；对照组未见梭形细胞生成,骨细胞周围可见胶原纤维,核基质致密靠边；4周时,实验组毛细血管数量增多,骨陷窝及骨小梁形成,有效对照组毛细血管数量也增多,但是骨细胞骨陷窝及骨小梁形成相对较少。而对照组毛细血管数量相对较少并伴周围有骨基质形成；6-8周时,实验组可见成骨细胞形成,胞质内粗面内质网数量明显增多。有效对照组可见骨原细胞相对活跃。而对照组骨原细胞数量少,骨基质大量形成,无明显骨小梁形成。 (4)免疫组织化学：1周时对照组、有效对照组和实验组IGF-1染色见骨细胞胞浆呈弥漫性淡染,但各组无明显区别,均呈弱阳性表达；2周时实验组骨原细胞染色加深,IGF-1染色呈阳性表达,有效对照组骨原细胞也可见部分加深,呈弱阳性表达,而对照组仍呈现弥漫性的淡染表达；4周时实验组IGF-1染色呈强阳性表达,伴随骨髓腔的形成,成骨细胞着色较深,软骨细胞也可见浓染。有效对照组IGF-1染色呈阳性表达,伴随骨髓腔的形成,骨细胞着色。而对照组也染色加深但浓度略淡于有效对照组、实验组,呈弱阳性表达；6-8周时各组骨组织细胞的IGF-1染色较前均呈相应程度的减弱表达,对照组呈弱阳性表达,有效对照组呈阳性表达,实验组仍呈强阳性表达。 (5)原位杂交：1周时对照组、有效对照组均与实验组无明显差异,IGF-1探针染色均呈弱阳性表达；2周时实验组IGF-1探针染色呈阳性表达。有效对照组IGF-1探针染色基质着色呈弱阳性表达,可见部分骨组织细胞着色,而对照组IGF-1探针染色着色较有效对照组略少呈弱阳性表达；4周时实验组IGF-1探针染色基质着色呈强阳性表达,有效对照组IGF-1探针染色见骨细胞着色呈阳性表达,而对照组IGF-I探针染色着色呈弱阳性表达；6-8周时各组均可见骨小梁形成,骨组织细胞数也较前增多,但骨组织细胞探针染色着色表达均较前开始减弱。有效对照组IGF-1探针染色呈弱阳性表达,而对照组IGF-1探针染色着色较有效对照组表达减弱。实验组IGF-1探针染色呈阳性表达。 (6) RT-PCR结果：IGF-I基因mRNA的相对表达量在第1-4周呈上升趋势,第6-8周呈下降趋势。实验组与有效对照组IGF-1基因mRNA的相对表达量均比对照组高,其中实验组IGF-1在第2-8周的相对表达量与对照组比较有显著性差异(P0.01),第1周最低,表达量为1.302±0.058；在第4周达到最高,表达量为3.914±0.273；有效对照组IGF-1在第2-8周的相对表达量与对照组比较有显著性差异(P＜0.01),第1周最低,表达量为1.278±0.074；在第4周达到最高,表达量为3.286±0.181。有效对照组IGF-1在1-8周的相对表达量均要低于实验组,其中在第4周的表达量两者比较有统计学差异(P0.01)。 结论：中西医结合治疗骨缺损疗效满意,中药复方“益肾健骨合剂”在自体骨修复骨缺损过程中能够增强胰岛素生长因子-1(IGF-1)的表达,有效加速骨缺损的修复过程,缩短骨缺损修复时间,为临床治疗提供必要的科学理论依据。