重组绿脓杆菌外毒素A系列毒素的ADP-核糖基化转移酶活性分析

【摘要】： 重组绿脓杆菌外毒素A（Recombinant ExotoxinA of Pseudomonas aeruginosa，rPEA）是单链毒素融合蛋白，具有分 子量小，结构简单，易于修饰等特点。利用基因重组技术制备的 rPEA系列毒素，作为新型抗癌生物导弹应用于临床已指日可待。 rPEA作为抗癌生物导弹药物的成品制剂，其作用机理及ADP- 核糖基化转移酶活性测定方法国内尚无报道。 ［实验目的］建立ADP-核糖基化转移酶活性检测方法，验证本 实验室构建、表达、纯化的三种rPEA具有ADP-核糖基化转移 酶活性，并分析LRH-PE40在纯化过程中的酶活性变化。 [方 法]1．选择粗制麦胚、兔网织红细胞裂解液、绵羊网织 红细胞裂解液制备真核细胞延长因子-2（Eukaryotic Elongation factor-2，EF-2）；2．建立放射性同位素[~14C］标记NAD底物测定 rPEA ADP-核糖基化转移酶活性的放射性活度分析方法；3．检测 三种rPEA的ADP-核糖基化转移酶活性。 [实验结果]1．三种不同来源（麦胚细胞，兔网织红细和绵羊网 织红细胞）的EF-2以绵羊网织红细胞来源的EF-2含量最高 （＞30pmol/10ul），放射活度最强（589.0cpm/10ul）；2．本实验室 所构建的三种rPEA工程菌发酵后菌体裂解液上清的ADP-核糖 基化转移酶放射性活度为EGF-PE40：101.0cpm/μg，-EGF- PE38：113.8cpm/μg，LRH-PE40：126.3cpm/μg；3．LRH-PE4O 发酵菌体裂解液上清经纯化后，杂蛋白去除率为99.88％，比活 性由纯化前的126.3cpm/μg提高到12818.4 cpm/μg，提纯101.5 倍。 l结论11．利用绵羊网织红细胞裂解液替代粗制麦胚、兔网织红 细胞裂解液制备＊F－2是可行的：2．本实验所建立的酶活检测方 活，重复性好，精确度高，是一种监测rPEA制剂质量指标的实 用、可靠方法；3．本实室表达的三种 rPEA（EGFGF－PE－40、LRHRH－ PE一0、卫GFPEl 8）均具有明显的ADP－核糖基化转移酶的 活性，提示o＊A系列毒素的作用机理与天然毒素相同：4＊N－ PE40经纯化后，比活度达到 12836．0 Cpln／卜g，超过精制天然 PEA 标准品（电泳纯）的 ADP－核糖基化转移酶活性门53 Cprn／pg） 63倍，为该制剂用于临床抗肿瘤治疗展示了光明前景。