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重组Clara细胞分泌蛋白对高氧性肺损伤的影响及其机制研究

金正勇  
【摘要】: 随着新生儿学的发展,早产儿的存活率大幅度提高,但支气管肺发育不良(BPD)的发病率反而逐年增加,严重影响存活儿的生长发育和生存质量。BPD是新生儿,尤其是早产儿高氧机械通气治疗最常见的并发症,但至今其发病机制尚不完全清楚,临床上尚无理想的药物可以防治BPD。 目前,以肺发育受阻为主要病理改变的“新型BPD”倍受关注。研究表明,BPD发生过程中炎症反应持续存在,而炎症能抑制出生后肺泡、小呼吸道和小血管的发育。细胞凋亡参与肺损伤的发病过程,肺泡上皮细胞的死亡是高氧性肺损伤的一个重要特征之一。高氧性肺损伤时由于Ⅱ型肺泡上皮细胞变性及破坏,肺表面活性物质相关蛋白(SP)分泌下降,使肺表面活性物质不能有效发挥其生物学作用,阻碍肺泡发育成熟。因此,呼吸道重塑的关键时期发生肺损伤可导致肺发育阻滞。 Clara细胞分泌蛋白(CCSP)是位于远端细支气管的无纤毛立方形上皮细胞-Clara细胞分泌的蛋白,是分泌型磷脂酶A_2(PLA_2)的抑制剂,具有抗炎等多种生物活性,参与体内一系列生理、病理过程,如炎症、组织重建等。CCSP在体内通过PLA_2的抑制作用,减少肺表面活性物质的降解、肺弹性回缩力的减弱及肺残气量的增加。Ramsay等研究报道,呼吸窘迫综合症患儿生后1d、3d、6d的支气管肺泡灌洗液中CCSP含量越低,将来越容易发展成BPD,提示BPD的发生与CCSP的变化高度相关。但国外诸多研究结果认为外源性CCSP可能通过抗炎机制,减轻肺损伤,尚未见与凋亡关系的研究报道。 因此,为了探讨BPD发生过程中肺内CCSP与肺泡上皮细胞凋亡之间的关系,本研究从组织、分子水平观察了BPD不同时程肺组织形态学改变及肺内CCSP、肺表面活性物质蛋白-A(SP-A)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达变化和细胞凋亡程度,以探讨高氧对肺发育和肺损伤的影响及其机制。此外,应用rh-CCSP进行体内外干预后,进行动态观察肺发育和肺内SP-A的表达及肺细胞凋亡程度,阐明了rh-CCSP对高氧性肺损伤的保护作用。本研究不仅对新生儿呼吸病理生理的理论意义,也为今后临床应用rh-CCSP防治BPD提供有力的理论和实验依据。 实验结果如下: 一、高氧性肺损伤的机制研究 1.高氧对新生大鼠死亡率的影响 随着暴露时间的延长,各组死亡率均呈增高趋势。空气组增高缓慢,而高氧组暴露7d后开始死亡率迅速增高,与空气组相比,差异有显著性,P<0.01。 2.高氧暴露后肺损伤情况 高氧暴露不同时期W/D值比较来看,空气组和高氧组3d时,W/D值无明显差异,P>0.05;高氧暴露7d、10d时,高氧组W/D值较空气组明显增加,差异有显著性,P<0.05;但14d时,差异不明显,P>0.05。高氧暴露后3d、7d的支气管肺泡灌洗液(BALF)中丙二醛54(MDA)含量明显高于空气对照组,差异有显著性意义,p<0.01。 3.高氧暴露后肺形态学变化 空气组3d时,肺组织基本结构单位为终末囊泡,腔大壁厚,分隔已开始,有脊突向腔内,囊泡壁内许多间质细胞,肺泡数目少;高氧暴露3d时,肺组织表现基本同空气组。空气组7d、10d时,脊明显增多,肺泡数目也渐增加;高氧组肺泡数目较空气组减少。空气组14d时,肺泡数目增加更显著,肺组织基本结构单位为肺泡,但肺泡壁较厚,仍有较多间质细胞;而高氧组肺组织结构紊乱,肺泡形成明显滞后,肺泡结构简单化和囊泡化。 4.高氧对新生大鼠肺组织CCSP、SP-A、TNF-α表达的影响 高氧组Clara细胞百分率明显少于空气组,差异有显著性,P<0.01;高氧组Clara细胞免疫阳性强度与空气组相比,差异有显著性,P<0.01。随着高氧暴露时间的延长,Clara细胞阳性率和CCSP表达强度降低,差异均有统计学意义,P<0.05。 高氧暴露7d,两组SP-A表达强度比较,差异无显著性,P>0.05;但高氧暴露14d后结果与早期相反,高氧组SP-A表达较对照组明显减少,差异有显著性,P<0.01。 western blot方法观察肺组织内SP-A表达,并进行半定量分析结果,高氧暴露3d时SP-A表达量高于空气组,差异有显著性,P<0.05;高氧暴露5d、7d时两组之间无差异,P>0.05。 高氧组TNF-α的表达强度明显高于空气组,其表达在高氧3d时高峰,高氧7d时有所下降,但仍明显高于空气对照组,差异有显著性意义,p<0.01。 5.高氧对新生大鼠肺组织细胞凋亡的影响 高氧暴露7d、14d时,肺上皮细胞凋亡指数明显高于空气组的测定值,差异有显著性,P<0.01;随着高氧暴露时间的延长,细胞凋亡程度加重,但不同时程组间比较,差异无统计学意义,P>0.05。 二、rh-CCSP对A549细胞凋亡的影响 高氧处量72h后A549细胞凋亡率较空气组明显增多,差异有显著性意义,P<0.01;高氧+rh-CCSP组细胞凋亡率较高氧组明显减少,差异有显著性意义,P<0.01;随着高氧处理时间的延长,细胞凋亡率增加。 三、rh-CCSP对高氧性肺损伤的影响研究 1.RAC值和形态定量分析:rh-CCSP组较高氧组RAC值明显增高,肺泡面积比明显减少,差异有显著性,P<0.01。 2.SP-A表达:高氧暴露7d时,各组SP-A表达水平,差异无显著性意义,P>0.05。但高氧暴露14d时rh-CCSP+高氧组较高氧组表达强度增强,差异有显著性意义,P<0.05。 3.TUNEL染色结果:高氧暴露7d时,rh-CCSP组细胞凋亡指数明显低于高氧组的测定值,差异有显著性意义,P<0.01。 结论 1.长时间暴露于85%高浓度氧可引起新生鼠肺损伤和肺发育阻滞。主要表现为肺W/D比值增加和肺泡数目减少、结构紊乱、RAC值减少等肺组织形态学的改变及死亡率上升。 2.高氧诱导肺细胞凋亡是BPD的重要机制之一,高氧可能通过增加TNF-α表达来诱导细胞凋亡。 3.Clara细胞和Ⅱ型肺泡上皮细胞是氧化损伤的主要靶细胞,因高氧致Clara细胞损伤,进而抑制CCSP分泌,加重肺损伤;随着高氧暴露时间的延长Ⅱ型肺泡上皮细胞变性、破坏,使SP-A分泌减少,使PS功能丧失,阻碍肺发育,促进BPD发生。 4.高氧暴露后A549细胞的凋亡增加,随着高氧暴露时间的延长,细胞凋亡程度加重,rh-CCSP能够有效抑制高氧暴露后肺上皮细胞的凋亡。 5.高氧暴露后肺内CCSP表达下降,阻碍肺泡发育,外源性补充rh-CCSP可逆转高氧引起的肺泡化障碍,还能增加肺内SP-A分泌,有效抑制肺细胞凋亡,减轻肺损伤,可预防和治疗BPD的发生。 本研究的创新点 国内尚无CCSP与高氧、BPD关系的研究报道,更没有rh-CCSP对高氧性肺损伤的影响研究。本课题选择rh-CCSP的抗凋亡作用为突破口,通过促进肺细胞的增殖、分化,抗细胞凋亡作用机制,减轻高氧性肺损伤的作用机理领域进行了新的探讨。 创新点:①国内首次进行重组CCSP与BPD、高氧性肺损伤的关系的实验研究; ②国内外首次用雾化吸入的方法,研究rh-CCSP的影响及其机制。


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