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稀土荧光配合物的合成及其蛋白质标记的研究

张蕊  
【摘要】:稀土元素由于其具有独特的荧光性质,包含Stokes位移较大、荧光强度高等优势,近几年来被广泛应用于生物标记免疫分析中,均相时间分辨荧光免疫分析(HTRF)就是其中之一。该技术的灵敏度较高,操作步骤便捷,已经广泛应用于生化实验与大规模生产中。为了制备与蛋白质标记的稀土荧光配合物,本文合成一种Tb~(3+)荧光有机配合物,确定并优化合成路线,对其结构进行表征,研究光谱性能,并与甲胎蛋白单克隆抗体进行标记,对蛋白质标记前后的免疫活性进行检测,同时探究最佳标记条件,表明此次实验合成的Tb~(3+)荧光配合物可以用于生物分子的标记。一方面以3-甲基邻羟基苯甲酸作为起始原料,通过修饰甲基、酸化等一系列反应,生成具有独特结构和性质的酰胺类结构化合物。另一方面,以二氯乙胺盐酸盐作为配体另一部分反应的起始原料,通过合环、开环反应生成杂环类化合物,再用溴化氢强氧化剂取代,生成氢溴酸盐。通过柱层析的阴阳离子交换除去溴离子,最后生成多氨基结构化合物N,N,N',N'-四(2-氨基乙基)乙二胺。使两种化合物在二氯甲烷作为溶剂的条件下反应,合成有机配体四甲基-4-H(2,2)-2-甲氧基异邻苯二甲酰胺-四噻唑啉,与5-氨基-(2-氨乙基)-H(2,2)-氨基叔丁酯反应,形成一个结构牢固的“笼子”有机配合物四甲基-叔丁氧羰基-赖氨酸-BH(2,2)IMA。通过对配体支链不断修饰,最终该化合物一端的“手臂”形成能与蛋白质牢固连接的-COOH端。将该有机配体与Tb~(3+)进行结合,使得该配合物具有荧光效应,通过质谱对该化合物进行确定,探究其光谱性能。结果表明,该稀土荧光配合物的最大激发波长为375nm,发射波长为583 nm,荧光寿命为1023.12,量子产率为13.3%,具有较好的荧光性能。将该Tb~(3+)荧光配合物用于标记AFP-McAb,测定标记后的免疫活性,确定不同环境下的最佳标记条件。实验表明,AFP-McAb的最佳包被浓度为5μg/m L;标记前后抗体的活性无明显变化,效价可达1:2400。在p H为6的条件下,活化Tb~(3+)荧光配合物10 h,为最佳活化时间;Tb~(3+)荧光配合物与抗体反应孵化时间为1.5 h时,达到最大标记率。以上结果说明成功的合成了Tb~(3+)荧光配合物,并证实了与AFP-McAb进行标记的可行性,为免疫分析技术提供了新的思路。


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