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Spinigerin a抗菌肽基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

翟立公  
【摘要】:抗菌肽是生物细胞特定基因编码产生的一类小分子多肽,是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障。具有广谱杀菌、水溶性好和热稳定性好等特点,且对较大的离子强度和较低或较高的pH都有较强的抗性,而对真核细胞几乎无作用,仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞,并且与抗生素通过阻断大分子生物合成的作用机制完全不同。目前抗菌肽的制备主要是通过提取法、化学合成法及基因工程法,然而根据其各种的特点来说,基因工程表达是大量获得抗菌肽的有效途径。 Spinigerin抗菌肽是一种来源于白蚁(Pseudacanthotermes Spiniger)的线性抗菌肽,包括25个氨基酸,不含半胱氨酸,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有较好的裂解性,但对人类的红细胞无溶血特性。Spinigerin抗菌肽包含一个稳定的a-螺旋结构(Lys4和Leu21),该结构也保留了抗菌活性。其抑菌机制是该a-螺旋结构和强静电吸引力与细胞膜表面的负极磷脂头部有重要作用。 本研究根据GenBank(ID:GI:13959577)中注册的Spinigerin抗菌肽的氨基酸序列,选取其具有a-螺旋结构的18个氨基酸片段,作为目的片段。利用毕赤酵母偏爱密码子原则设计合成目的片段的基因序列及其引物。并将其连接到pPICZa A质粒上,构建成外分泌型重组表达载体pPICZa A-Spinigerin a。通过质粒载体大小的对比、双酶切的鉴定及PCR扩增的鉴定,可证实获得的表达载体即为目的重组载体,为重组表达奠定了基础。 在表达的过程中,选择毕赤酵母GS115为目的蛋白的表达系统。酵母转化需要大量的DNA,所以需要大量制备表达载体pPICZa A-Spinigerin a,并用Sac I单酶切使重组质粒pPICZa A-Spinigerin a线性化,通过电转的方法将其转入GS115酵母菌体内。利用具有梯度浓度的Zeocin抗生素筛选高拷贝,且高抗性的转化子。28-30℃培养2-7d,挑取重组菌GS115-S a单菌落提取该酵母基因组,进行PCR鉴定。通过紫外线观察,成功获得目的条带。通过筛选获得转化子GS115-S a进行甲醇诱导表达,得到的发酵上清液进行细菌的抑菌试验。通过对抑菌圈的测定,发现获得的表达上清液对革兰氏阴性及阳性细菌均有较好的抑菌效果。 综上所述,本研究成功的构建出表达载体pPICZa A-Spinigerin a,并将其转化到宿主毕赤酵母细胞GS115,获得重组菌GS115-S a。在甲醇诱导表达过程中得到的表达上清液已被证实具有一定抗菌活性,该研究为Spinigerin a抗菌肽的进一步研究奠定了一定基础。


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