猪带绦虫六钩蚴HSP的克隆表达及差异蛋白研究

【摘要】：猪带绦虫(Taenia solium)是一种重要的人兽共患寄生虫,其六钩蚴发育成囊尾蚴可引起人和猪的囊虫病。寻找六钩蚴发育成囊尾蚴的过程中关键因子或者差异蛋白变化将可能解释六钩蚴发育成囊尾蚴的生长变化规律,以及可能揭示六钩蚴突破宿主肠粘膜机理。而热休克蛋白(HSP)则跟生物体生长、蛋白合成及适应外界刺激有密切关系。本实验成功构建了pET28a-HSP重组抗原,为研究寄生虫热休克蛋白与宿主关系提供理论基础。1.激活的和未激活总蛋白分离及差异蛋白分析鉴定 本实验通过二维液相蛋白分离系统(2D-LC)对模拟肠道环境体外激活和未激活的猪带绦虫六钩蚴总蛋白进行分离,在pH值7.71-5.31范围内成功获得已激活的总蛋白208个,未激活总蛋白197个,其中相同共有164个,相对激活的差异蛋白共有44个,相对未激活的蛋白共有33个,根据已发布的热休克蛋白的等电点及疏水性等特点,选取5个已激活的差异蛋白进行蛋白质肽质量指纹谱的分析,成功鉴定了猪带绦虫磷酸甘油醛脱氢酶蛋白和小热休克蛋白(HSP),其它三个未鉴定出序列。2.HSP目的基因的克隆和测序 分别提取猪带绦虫激活和未激活六钩蚴总RNA, RT-PCR扩增HSP目的基因,将目的基因与pGH克隆载体连接,经酶切鉴定后,将阳性重组质粒进行测序,结果扩增出激活的六钩蚴的目的片段,未扩增出未激活的六钩蚴的目的片段,与分离出的小热休克蛋白结果一致。测序分析证明本试验扩增的基因序列与Genbank上发表的猪带绦虫六钩蚴热休克基因核苷酸序列同源性为100%,与鉴定出的小热休克氨基酸序列一致。说明成功克隆了猪带绦虫六钩蚴小热休克蛋白序列。3. pET28a-HSP重组抗原的表达 将目的基因亚克隆到原核表达载体pET-28α中,并将获得的pET28a-HSP阳性重组子转化至宿主菌E.coliBL21,IPTG进行诱导表达,并对重组抗原pET28a-HSP进行SDS-PAGE和Western-blot检测。结果表明重组经SDS-PAGE分析可见一条约35kDa大小的融合蛋白条带的抗原,Western-blot结果显示其能被囊虫病人阳性血清识别。这将为进一步阐明六钩蚴入侵中间宿主的机理、设计新型抗猪囊虫病和绦虫病疫苗打下基础。