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大麦核糖体失活蛋白基因的克隆及在大豆中的转化

王鹏  
【摘要】:大豆,一年生豆科草本植物,原产地中国,现在大豆的种植已经遍及整个世界。大豆疫霉根腐病是大豆的一种常见病害,分布广泛危害严重而且防治困难,对大豆生产的危害极大。这种病害可发生在大豆的各个生育时期,并且几乎可以侵染植株的各个部位,使植株死亡,降低产量。传统防治根腐病的方法虽然有一定的效果,但是工作量大,长期使用农药严重污染环境,根腐病菌可能产生抗药性,后期农药处理不好对人体也有危害。目前,传统的抗病育种手段周期长,效率低;而且抗性资源有限,抗性容易退化,难以满足生产的需要。而植物转基因技术为抗病新品种的培育及种质资源的创新开辟了新的途径。 核糖体失活蛋白(Ribosome-inactivating Protein, RIPs)是一种能够杀死病毒、真菌和昆虫细胞的蛋白质,通过破坏外源细胞的核糖体,使蛋白质无法在细胞内合成,从而达到杀死细胞的目的。经过近一百五十年的探索和研究,科学家已经发现了一百余种核糖体失活蛋白,而且对其作用机理、酶学活性等也有了一定的了解,有一些种类的核糖体失活蛋白已经被应用,开始为人类服务。 启动子对外源基因的表达效率影响很大,选择合适的启动子能够使外源基因的表达量明显提高。根部特异性启动子是组织特异性启动子的典型代表,它能够使外源基因只在根部表达,可以避免对植株基础物质的浪费。 本实验利用PCR技术克隆大麦核糖体失活蛋白基因,将其插入到含有甜菜碱醛脱氢酶BADH基因的植物表达载体pCAMBIA1301-BADH中,构建成以耐盐基因badh为筛选标记的安全型植物表达载体pCAMBIA1301-BADH-RIP。为了目的基因可以大量的表达,将CaMV35S启动子和大豆根部特异性启动子分别插入RIP基因的上游,构建成新的植物表达载体pCAMBIA1301-BADH-35S-RIP和pCAMBIA 1301-BADH-RSP-RIP。通过农杆菌介导法将含有RIP和badh双价基因的表达载体导入大豆品种‘吉农28’子叶节中,用浓度为200mmol/L的NaCl选择培养基进行筛选培养,对获得的抗性转基因植株进行PCR检测,以期选育出抗灰斑病转基因大豆新品系。结果表明从部分抗性植株中扩增出RIP基因,初步证明含有CaMV35S启动子的RIP基因成功地转入到受体大豆品种中,获得了转基因阳性植株。两种载体利用花粉管通道法也获得相应的种子,经萌发长大后对其进行PCR检测,结果表明从部分植株中扩增出RIP基因。 主要研究结果如下: (1)构建成以抗旱耐盐基因badh为筛选标记的安全型重组植物表达载体pCAMBIA1301-BADH-35S-RIP和pCAMBIA1301-BADH-RSP-RIP。 (2)农杆菌介导法和花粉管通道法将外源核糖体失活蛋白基因导入大豆,获得了T0代再生植株和转化籽粒,以及T1代转基因植株。 (3)对转基因植株进行PCR检测,得到农杆菌介导法获得的T1代阳性植株18棵。花粉管通道法获得的种子共438粒。


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