SRAP在猴头菌属中的菌种鉴定及遗传关系分析

【摘要】：本论文建立了猴头菌菌丝体基因组DNA的高效提取方法和SRAP标记体系,并利用SRAP标记对17个猴头菌(Hericium erinaceus)菌株进行了亲缘关系分析和菌株鉴定,为猴头菌菌株资源的鉴定、利用和保护提供一定的科学依据。 实验结果表明,改良后的SDS-CTAB法提取得到的猴头菌菌丝体基因组DNA质量较好。实验中摸索获得的提取缓冲液中CTAB、PVP的量和是否加SDS以及部分操作步骤的调整,有效的避免DNA溶液褐变、去除了猴头菌菌丝体中蛋白质等杂质,得到较纯净的DNA,因而有效的减少了蛋白质、多糖、酚类和色素等杂质对SRAP分析的干扰。获得的基因组DNA的OD260/OD280值在1.75～1.94之间,DNA含量在220～770 ng/μL间,条带完整清晰、无降解现象,满足SRAP分析对DNA的要求。 通过对SRAP-PCR反应体系中各因素进行的单因素实验和正交实验,建立了适用于猴头菌SRAP分析的扩增程序和扩增体系,最佳SRAP扩增程序为：94℃预变性4 min；94℃变性45s,35℃复性45s,72℃延伸1 min,5个循环;’94℃变性45s,50℃复性45s,72℃伸1 min,35个循环;72℃延伸8 min; 4℃保存。最佳SRAP扩增体系(25μL)为：10×buffer 2.5μL、模板DNA为20 ng、Mg2+浓度为2.4 mmol/L、dNTPs浓度为0.2mmol/L、引物浓度为0.48μmol/L、TaqDNA聚合酶为4U。 本研究采用SRAP技术对供试的17个猴头菌菌株进行了亲缘关系分析和菌株鉴定。通过引物筛选实验,从48个引物组合中共筛选出18个扩增产物条带清晰、稳定、丰富、多态性高的引物组合。通过SRAP分析,17个猴头菌菌株共获得2565个扩增条带,扩增片段长度在50-2000bp之间,其中多态性条带2546个,多态性比率为99.3%。 通过对SRAP扩增图谱的分析,有6个引物组合扩增出了7条供试菌株共有的片段长度不等的条带。用UPGMA法建立了17个猴头菌菌株的遗传关系聚类图,聚类结果显示,在相似系数为0.68水平上,供试菌株被聚为4个大类。 酯酶同工酶分析聚类结果显示,在相似系数为0.60的水平上,可以将17个猴头菌菌株聚为3个大类。 通过对SRAP标记和酯酶同工酶标记的聚类结果比较分析,结果显示两种标记方法将供试菌株在0.68和0.60的相似水平上聚为四类和三类,其中部分聚类结果是一致的,因此,可以认为SRAP标记方法运用到猴头菌属的亲缘关系分析和菌株鉴定研究中是可行的；在两个标记分析的结果中都显示吉星猴头和黑丰猴头之间的相似性系数最大,表明两菌株的亲缘关系最近,可能存在“同物异名”的现象。