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重组人角质细胞生长因子-2(rhKGF-2)高密度发酵、纯化及其工程化研究

田海山  
【摘要】:随生物技术的日益进步和发展,利用基因克隆技术、基因组学、蛋白质组学、生物信息学等相关技术,构建已知或未知的蛋白并进行功能与性质的研究己成为可能。但要将基础研究成果进行中试放大、实现产业化,还需解决许多技术上的困难。因为它不仅与上游表达系统构建相关,还与下游发酵、纯化等各环节均有密切关联,同时由于生物制品的特殊性,包括稳定性、生物学活性及安全性等,还需建立相应的检测方法与质量标准。这使得许多科研成果仅限于基础研究,停留于实验室研究水平,不能满足企业生产和商品化的需要。 角质细胞生长因子-2(Keratinocyte growth factor-2, KGF-2)又称为成纤维细胞生长因子-10。主要是由成纤维细胞及其他间充质来源的细胞分泌,通过间质-上皮相互作用的旁分泌方式发挥作用,特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移。具有修复创伤、防止癌症化疗后黏膜炎症、治疗静脉溃疡、糖尿病溃疡、角膜炎、抗辐射损伤等多种作用,具有广泛的临床应用前景。目前在研究和开发角质细胞生长因子-2中普遍存在问题是蛋白可溶性表达量低及产物量低,生产工艺繁琐,回收率及蛋白稳定性差,已成为严重影响其实现工程化的瓶颈。因此,对KGF-2的工程化研究具有重要的意义。 目前,国外用于静脉溃疡、化疗引起的黏膜炎及溃疡性大肠炎治疗已进行Ⅱ期临床实验;国内开发的外用冻干粉及生物流体膜剂型,用于抗溃疡及促伤口愈合,也已进入临床阶段。本人所在的生物反应器与药物开发教育部工程研究中心也正在进行用于治疗角膜损伤的生物制品一类新药KGF-2滴眼液的开发。 本研究主要内容为构建高效表达工程菌株,建立高密度发酵、纯化生产工艺及质量检测标准,为工程化生产奠定良好的实验基础。主要研究结果如下: 1.构建了高效表达的pET3c-rhKGF-2/E.coli BL21 (DE3) plysy工程菌株,并经过连续传代50代,质粒丢失率仅为2%且工程菌的形态特征无明显差异;不同代次酶切得到的DNA片段大小与预期相一致,证明插入的目的基因没有因细胞分裂而丢失;原代与传代第50次菌株的表达水平无明显差异,表明工程菌株可稳定表达,并进行Western blot鉴定,表明工程菌具有良好的遗传稳定性。表达量测定结果目的蛋白可占总蛋白的30%以上,且细胞破碎后,目的蛋白大部分存在于上清中,表明重组蛋白可溶性表达。 2.通过摇瓶条件,对影响工程菌发酵的因素包括温度、pH值、溶解氧、乙酸浓度及诱导条件进行了优化,并通过正交实验确定适宜的培养基组成,在此基础上建立了高密度发酵培养技术。菌体培养阶段根据溶氧变化情况,调节碳源流加速率;在产物表达阶段,根据pH变化情况,调节碳源流加速率的补料流加生产工艺,获得较高的产物量及表达量。IPTG诱导连续三批发酵平均菌体湿重75.7g/L,平均表达率达33.66%。 3.试验采用乳糖作为IPTG的替代物,进行外源蛋白的诱导表达。与IPTG不同的是它必须借助乳糖通透酶作用进入细胞,并经β-半乳糖苷酶作用转化为异乳糖后方能起诱导作用。同时乳糖本身作为一种碳源,不断被细菌代谢利用。因此乳糖作为诱导剂的诱导过程,其诱导浓度始终处于动态变化过程中,诱导过程更加复杂,需对其诱导条件进行更细致的研究和优化。本文在IPTG诱导基础上,对乳糖诱导工艺进行了优化,乳糖诱导三批发酵平均菌体湿重达105.5g/L,平均表达量达32.44%,已达到工程化生产的要求。 4.建立了适合工程化生产的纯化工艺,简化了工艺流程,提高了产品收率。根据目标蛋白性质和特点,采取阳离子交换柱层析和肝素亲和柱层析两步层析法。利用AKTAPurifer10蛋白纯化系统,在盐浓度为0.1-2.0mol/L范围内进行梯度洗脱,求出目的蛋白洗脱峰的盐浓度及电导率,并以此为依据进行等梯度洗脱,摸索出较为优化的纯化工艺并进行中试规模的放大,确定纯化缓冲液的组成。选择醋酸盐缓冲体系(pH4.0、5.0)、柠檬酸缓冲体系(pH5.0、6.0)、磷酸盐缓冲体系(pH6.0、6.5、7.0)及Tris-HCl缓冲体系(pH7.5、8.0),考察了不同缓冲体系、pH值及保存温度对蛋白稳定性的影响,并进一步优化了纯化生产工艺。经优化后的纯化工艺连续三批生产,平均蛋白得率为745mg/200g湿菌体,纯度达到99.0%。 5.建立了rhKGF-2原液质量检测方法与标准。采用UItraflexⅢTOF/TOF Mass Spectrum Report质谱分析测得本生产工艺获得的rhKGF-2的分子质量为19446D,与理论分子量相一致;N端测序结果,与报导相一致;建立了高效液相检测方法,测得原液纯度高于98.0%; Western blot分析结果纯化的蛋白能与抗体产生免疫反应;部分安全性测定结果符合2005版中国药典第三部相关要求。在生物学活性测定中采用KGF-2高亲和力结合的FGFR2-Ⅲb功能基因通过慢病毒介导BaF3细胞(小鼠原B细胞)的转受体FGFR2-Ⅲb的BaF3细胞株进行KGF-2促增殖活性的研究。实验结果呈典型的S型曲线,并在一定范围内具有剂量依赖性,批间差异和批内差异均小于10%,显示出良好的重复性和可靠性。 总之,本文对重组人角质细胞生长因子-2(rhKGF-2)高密度发酵、纯化及其工程化进行了较为详细的研究,建立了高密度发酵生产工艺及适宜的纯化生产工艺,并建立了质量标准,已达到实现工程化生产水平的要求,为该产品的进一步研究和开发奠定了良好的基础。


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