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人铜锌超氧化物歧化酶在毕赤酵母中高表达及其中试工艺研究

迟春萍  
【摘要】:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,简称SOD)是一类金属酶,是生物体防御氧化损伤的重要酶类,广泛存在于需氧生物,耐氧生物和某些厌氧生物中。目前已知的SOD主要分为三类,即Fe-SOD,Mn-SOD和Cu,Zn-SOD。 超氧化物歧化酶能够催化超氧阴离子自由基歧化为过氧化氢与氧气。此酶在保护机体免受超氧自由基以及由其生成的活性氧类的氧化伤害过程中起着极其关键的作用。目前,SOD已经在化妆品,保健食品添加剂等方面得到了广泛的应用。Cu, Zn-SOD的稳定性高于Mn-SOD,并且在哺乳动物中含量远高于Mn-SOD,因此众多学者更重视Cu, Zn-SOD在临床上的应用。 目前国内市场上的SOD大多采用动物血液或植物提取,因此在使用效果及免疫原性方面都存在着不足,而且人体对这种异种蛋白的耐受性尚需进一步研究;在提取过程中,容易发生致病微生物污染及有机试剂残留;欧盟从1997年1月起禁止使用动物SOD,基因工程SOD从根本上克服了动植提取SOD的各种弊病(主要是病毒交叉感染),决定了该项目开发的美好前景。 本课题根据酵母密码子偏好性化学合成人Cu, Zn-SOD基因,并将其克隆至整合型真核分泌表达载体pPIC9K,用不同的电转条件转化毕赤酵母GS115,用MD和MM平板进行表型筛选,获得阳性转化子,以甲醇诱导实现分泌表达。本研究建立了rhCu, Zn-SOD中试发酵纯化工艺,建立了rhCu, Zn-SOD脂质体载酶工艺,为rhCu, Zn-SOD的产业化奠定了基础。 Pichia. Pas toris基因表达系统经过近十几年发展,已基本成为较完善外源基因表达系统,具有易于高密度发酵,表达基因可以稳定整合在宿主基因组中,能分泌表达目的蛋白并适当糖基化等特点。目前美国FDA已具备评价来自该系统的基因工程产品的能力,来自该系统的Cephelon已获得FDA批准,所以该系统被认为是安全的。 本研究成功构建了4株GS115/Cu, Zn-SOD转化子,用Southern blot法检测GS115/Cu, Zn-SOD转化子拷贝数量,对其中拷贝数量较高的3株传代,考察基因整合的稳定性,转化子的生长曲线表明了重组酵母菌16h后进入对数生长期,24小时后进入生长稳定期,试验确定了最佳诱导时间。对其中的高拷贝转化子进行了摇瓶培养和罐培养的条件优化,首先在摇瓶水平上进行单因素培养条件优化,最适培养条件为:初始pH6.0,维持1.5%甲醇浓度,72小时收获,然后设计4因素3水平正交实验获得了摇瓶培养的最适条件:1.5%甲醇诱导,pH6.0,温度30℃,72小时收获。最适摇床诱导表达可得到大于600 U/ml的酶活性的二聚体蛋白,其分子量为40KDa,单体分子量20KDa,低糖基化,均为分泌表达,对Cu,Zn-SOD抗体具有特异性反应。电泳薄层扫描分析,目的蛋白占外分泌蛋白总量的79.6%。用组装的双抗体夹心ELISA检测试剂盒检测蛋白后计算可知,目的蛋白占总蛋白的65%,表达量为70mg/L。从酶的稳定性实验可知:粗酶在氯仿、丙酮和乙醇中60min内稳定,对H2O2不稳定,在85℃15分钟内和pH4-10范围内都较稳定。 在优化摇瓶培养条件的基础上设计正交试验,确立了大罐的发酵工艺,即以A600200为起始诱导的菌浓度诱导,在pH6.0,温度25℃,2ml/min流速流加甲醇条件下rhCu, Zn-SOD表达活性及蛋白含量最佳。极差分析也显示了甲醇浓度对诱导表达的影响最大,同时也表明,罐培养时,适当降低温度更有利于蛋白的分泌表达。以优化的最适条件进行罐培养,rh Cu,Zn-SOD目的蛋白占总蛋白的66%,表达量为615mg/L,活性大于5000U/ml,比活性大于9×103U/mg,比摇瓶培养条件所获得的目的蛋白活性及蛋白表达量高8倍。 高密度罐发酵的重组大Cu, Zn-SOD发酵液超滤浓缩5倍后,重组人Cu, Zn-SOD活性及蛋白回收率可达100%,纯化率达85%。小量实验确立了阴离子交换层析条件,摸索了最佳盐析及凝胶过滤条件,五批纯化结果显示,每批原液中重组人Cu, Zn-SOD的浓度都在lmg/ml以上,比活性6 x 103U/mg,重组人Cu, Zn-SOD目的蛋白活性及蛋白回收率大于70%,纯度达95%以上,各项质量指标均符合生物制品中基因工程产品的检定规程。 本研究建立了rhCu, Zn-SOD蛋白含量及活性检测方法。参照抗体技术实验指南制备用于检定rhCu, Zn-SOD特异性的单克隆抗体及多克隆抗体,并建立了以多克隆抗体包被,单克隆抗体标记的双抗体夹心ELISA检测方法,组装了用于检测发酵液表达目的蛋白检测试剂盒。经鉴定,最低检测极限为18.75ng/ml,批内CV10%,批间CV15%,特异性良好。克服了生化检测带来的偏差,真实反映了发酵液中rhCu, Zn-SOD目的蛋白的表达量。为表达研究提供了可靠的检测手段和实验依据。rhCu,Zn-SOD纯品参照中华人民共和国药典三部2005版的有关基因工程制品原液检定项目进行全面检定。用非还原SDS-PAGE法和HPLC法检查rhSOD纯度,Western blot法检查特异性,还原SDS-PAGE法检查分子量,考马斯亮蓝法及双抗体夹心ELISA法检测蛋白含量,用活性检测试剂盒测定酶活性,地高辛标记法检测残余DNA,酶联免疫法测定残余蛋白,鲎试剂法测定纯品的内毒素,微生物检查法检测无菌试验,等电聚焦法检测Cu, Zn-SOD的等电点,用Edman降解法测定rhCu, Zn-SOD的N末端氨基酸序列。检测结果符合生物制品各项检测指标。 为了能更好的应用,本研究对纯品进行脂质体载酶研究,采用本课题组较成熟的旋转蒸发法制备脂质体技术,结合冻干水重建脂质膜的方法,正交设计了优化脂质体修饰rhCu, Zn-SOD条件,分析影响因素,用最适的优化条件制备rhCu,Zn-SOD脂质体,粒径平均80nm左右。进行Cu, Zn-SOD脂质体的稳定性实验,用凝胶过滤法分离游离蛋白及rhCu, Zn-SOD脂质体以计算脂质体包封率,制备的脂质体包封率最高达85%。4℃和室温放置6个月包封率下降不明显。可以规模化制备稳定的rhCu, Zn-SOD脂质体。药代动力学显示rhSOD脂质体明显提高了体内的半衰期,提高了该制品的生物利用度,血中及肝脏组织中生物利用度分别为195.94%和134.86%,为rhCu, Zn-SOD的临床应用奠定了基础。


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