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木耳属遗传多样性及原生质体育种的研究

孙露  
【摘要】:木耳属食用菌的营养价值极高,而热量却很低,是一种非常健康的食药用菌。本试验以45株木耳属菌株为供试材料,对木耳属品种的体细胞不亲和性、酯酶同工酶、温型多样性及菌落形态进行研究,探明木耳属种质资源多样性,同时筛选出优良菌株。应用原生质体再生无性系及原生质体融合技术选育木耳属优良新品种,优化原生质体制备及再生条件。试验结果如下: 1、木耳属种间颉颃类型丰富 体细胞不亲和性试验结果表明,木耳属种间颉颃类型丰富,包括沟型、隆起型、隔离型和平铺型。在所有的颉颃现象中,沟型占绝大部分。黑木耳种内的颉颃类型主要以隆起型为主,而沟型、隔离型较少,没有叠生型且颉颃程度一般。 2、木耳属菌株酯酶同工酶谱带差异较大 供试菌株共有48条迁移率不同的谱带,其中有15条谱带为单个菌株特有的酶带,呈现出丰富的多样性。木耳属菌株1602(红)与1615(红);1612(毛)与1614(薄);1631(瑞丽)与1634(瑞丽);1635(瑞丽)与1636(瑞丽)的亲缘关系极近,可能是同一个种。分析黑木耳品种间酯酶同工酶图谱可知,菌株A110、A118、A120相似性极高,菌株A112与A113相似性极高,初步认定他们为同物异名。 3、木耳属菌株温度范围较广 温度试验结果显示,木耳属食用菌生长最适温度范围是15℃至35℃之间,30℃更适宜木耳属菌株生长。1613(红厚)、1614(薄)、1623(黑)为低温型菌株,1604(红厚)、1605(黑)、1611(毛)为高温型菌株,1602(红)、1607(薄)、1615(红)为广温型菌株。黑木耳最适生长温度为35℃,A113和A121为耐低温品种,A110和A120为耐高温品种。 4、木耳属菌株菌落型态丰富 大多数木耳属菌株菌丝呈丝状、菌落圆形、菌丝较密、气生菌丝少、边缘整齐、无色素分泌;少数菌株会出现菌丝绒毛状、菌落形状不规则、菌丝稀疏、气生菌丝多、边缘不整齐、有黄褐色或黑色色素分泌的现象。根据液体培养菌球形态可以将木耳属菌株分为四类,即絮状、绒毛状、杨梅状及颗粒状。黑木耳种内品种液体培养菌落形态单一,均为颗粒状。 5、优化出原生质体制备及再生适宜条件 通过对木耳原生质体制备条件中的出发菌龄、融壁酶种类及浓度、酶解温度及酶解时间、渗透压稳定剂种类及浓度的比较研究,最终确定木耳原生质体制备的最佳条件:菌龄5d;融壁酶浓度为1.5%,酶解温度30℃,酶解时间3h;渗透压稳定剂选择甘露醇,浓度为0.5M。在最佳酶解条件下,原生质体数量可达到1.1×107个/ml。最适双层再生培养基配方为:马铃薯200g,葡萄糖20g,蛋白胨2g,MgS040.5g,K2HP041g,KH2P040.46g,VB110mg,琼脂15g/8g,0.5M蔗糖,水1000ml。 6、选育出6个优良原生质体再生无性系菌株 通过颉颃试验和酯酶同工酶试验的鉴定,从原生质体再生无性系菌株中筛选出19个遗传性状有别于亲本的具有遗传特性的再生菌株,进一步通过菌落型态、菌丝生长速度和发菌时间的比较分析,从中选出6个优良再生菌株。 7、选育出4个优良原生质体融合菌株 木耳属原生质体融合子鉴定结果显示,有18株融合子与亲本产生明显的颉颃现象,说明这18株融合子在原生质体灭活和融合过程中产生了核遗传要素的变异。将融合子与两亲本进行酯酶同工酶比较分析,所有融合子均出现特异性新谱带,一般为2-7条。融合子A2、B4、B6、C2、C4、C7、C8、C11与双亲谱带都明显不同,表现出较强的杂种优势。通过菌丝生长速度和发菌时间的比较分析,最终筛选出4个超亲品种,包括A2、B4、C9、C16。其中,B4是黑木耳与毛木耳的种间融合子。 8、创新最佳原生质体融合体系 本研究通过科学系统的试验,总结归纳出简便实用且科学有效的原生质体融合体系:首先,利用原生质体单核化技术分别获取双亲的单核原生质体再生菌株作为融合亲本;其次,分别采用热灭活和紫外灭活法对两个单核菌株的原生质体进行遗传标记;最后,利用PEG法在适宜条件下对不同方式灭活的两个原生质体进行融合。由于融合双方的互补作用,可以得到与双亲遗传性状不同的双核融合产物。


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