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重组大肠杆菌高密度发酵生产Ⅵ型胶原蛋白的工艺研究

魏玮  
【摘要】:胶原蛋白是由动物的成熟纤维细胞合成的一类生物大分子,具有支撑器官和保护组织的功能。胶原蛋白Ⅵ(collagen VI)属于胶原大家族的成员之一,是普遍存在于胞外基质的功能蛋白,其显著特征是分子量大和半胱氨酸含量高,由α1,α2和α3三亚基组成。由于其良好的生物学特性,可以促进间质细胞和软骨细胞的生成与迁移而维持组织的完整性,并且机械性能良好,适合做人工血管和手术缝合线等生物医用材料。 本文以含有Co16A2全部序列的重组质粒pMD18-T-Co16A2为模板,利用Primer5.0软件并参照pET-22b的酶切图谱自行合成特异性引物P1和P2,通过PCR扩增技术获取目的基因片段,将产物与表达载体pET-22b连接后转入感受态大肠杆菌成功构建新型重组菌E.coliBL21(pET22b-Co16A2)。以此重组菌作为实验室摇瓶实验和小试实验的发酵工程菌,针对其自身特性和代谢系统对高密度发酵培养基和工艺条件进行了系统研究。利用Plackett-Burman实验和响应面分析法对胶原蛋白发酵培养基进行优化,并建立3种主要因素(葡萄糖、混合氮源和磷酸氢二钾)与胶原蛋白产量之间的函数关系。含量测定是利用bandscan5软件对发酵液SDS-PAGE凝胶电泳的条带分析而计算胶原蛋白占总蛋白的百分比例。确定出最佳培养基组成为(g/L):葡萄糖14.69、混合氮源15.04、K2HPO411.91、(NH4)2SO44.5、NH4Cl4.5、NaH2PO44.5、MgSO41、NaCl4。采用单因子法分别研究摇瓶实验中诱导时机、诱导时间、诱导剂浓度、接种量、初始pH值和诱导温度对菌体生长和胶原蛋白表达的影响。优化的最佳发酵条件:诱导时机为指数生长中后期(对应OD600为3.8)、诱导时间5h、IPTG终浓度0.6mmol/L、接种量2%、初始pH为7.0,菌体初始培养温度37℃、诱导温度30℃,发酵9小时。在优化后的培养基和发酵条件下重组菌的OD600为4.79,菌体干重为1.904g(DCW)/L,胶原蛋白表达量可达30.5%,分别是初始条件下的2.08倍和2.01倍。通过对菌体进行诱导培养和非诱导培养实验对比,证明诱导剂IPTG对菌体生长和质粒稳定性影响微弱。 在高密度细胞发酵中以摇瓶实验结果为基础采用分批补料方法对重组E.coliBL21(pET22b-Co16A2)的工艺条件和补料方式进行了研究。综合比较DO-star流加法、pH-star流加法、指数流加法和指数恒pH流加法对重组菌生长和重组基因表达的影响。优化结果为诱导时间6h、生长阶段pH7.0、诱导阶段pH6.5、生长阶段DO为30%、诱导阶段DO为40%,由于发酵罐中营养物质充足且空间级别大等特点,其工艺过程与摇瓶实验结果具有差异性。采用(?)O-star流加法时OD600和蛋白表达率分别为50.83和34.25%;pH-star流加法的结果分别为51.48和32.4%;指数流加法结果为60.3和33.4%;指数-pH混合流加法最适于重组E.coli的生长和胶原蛋白的表达,其OD600达58.43,菌体干重为22.03(DCW)/L,胶原蛋白表达量达35.9%。最终高密度发酵全过程确定为以指数-pH混合流加法为补料策略,采用pH、温度和溶氧三因素两阶段调控方式在菌体对数生长中后期(对应OD60045)加入IPTG(终浓度0.6mmol/L)诱导培养6h。


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