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SRAP标记和SCAR标记在黑木耳栽培菌株分类鉴定中的应用

李媛媛  
【摘要】:采用序列相关扩增多态性(SRAP,sequence-related amplified polymorphism)的分子标记方法对50株黑木耳栽培菌株进行亲缘关系分析。通过PCR扩增,电泳结果统计,UPGMA聚类分析得到50株菌株的分类树状图。在PCR电泳图谱中发现了黑931一条特异性条带,将其成功转为SCAR标记。具体实验结果如下: 1.采取改进的CTAB法提取基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳检测谱带整齐,OD比值结果大部分都在1.7-2.0的范围之内,说明本实验采用的CTAB法可以有效的提取DNA并且适用于PCR实验。 2.经单因素实验优化及正交试验优化后,得到SRAP-PCR的最适反应条件:25μL体系,模板0.8μL, Mg2+2.5μL, dNTP2.2μL,引物1.3μL,酶0.5μL,10×PCRbuffer2.5μL,后用ddH2O补齐。PCR反应程序为:94℃5min;94℃1min,35℃1min,72℃1min,5个循环;94℃1min,50℃1min,72℃1min,35个循环;72℃10min延伸;4℃保存15min。 3.从36对供试的引物对中筛选出3对扩增结果较好的引物对他们是em1-me5 em2-mel和em5-me2。三对引物共扩增出40条带,其中38条为多态性条带,多态性比率为95%,平均每条引物扩增13.3条带,多态性条带12.7条,多态性比率95.4%,多态性较丰富。其中引物对em2-mel的扩增图谱中发现黑931菌株有一特异性条带,约1200bp。 4.经UPGMA分析后,供试的50株菌株相似性系数介于0.52-1.00之间。在相似性水平为0.60时,可将供试菌株分为五个大类,各菌株间遗传相似性系数较高(≥0.52),遗传多样性丰富。 5.黑931的特异性条带经回收、克隆、测序得到1135bp的序列。应用primer5.0软件设计了一对特异性引物对,通过实验摸索最终确定SCAR-PCR反应体系为25μL体系,模板0.8μL, Mg2+2.5μL, dNTP2.2μL,引物1.3gL,酶0.5μL,10×PCRbuffer2.5μL,后用ddH2O补齐。PCR反应程序为:94℃5min,94℃1min,64℃30s,72℃1.5min,30个循环;72℃10min延伸。 6.应用特异性引物对扩增供试菌株,黑931模板得到约1000bp大小的片段,符合特异性引物对扩增序列片段的大小,说明成功构建出了该菌株的指纹图谱。


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