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转基因靶分子CP4-EPSPS单克隆抗体的制备及其ELISA检测方法研究

李忠鹏  
【摘要】:中国是世界上最大的大豆进口国,每年都会从美国、巴西和阿根廷等国进口大量的转基因大豆。近年来,随着科学的进步,转基因产品安全性问题越来越受到人们的重视。因此,建立一套快速、有效的检测方法以加强对转基因产品的监控和管理是十分必要的。目前,国内外对于转基因产品的检测普遍采用外源基因检测法,例如PCR法、Southern杂交等,而外源蛋白检测法应用相对较少。本研究通过基因克隆、蛋白表达和纯化获得了高纯度的重组CP4-EPSPS蛋白。以重组CP4-EPSPS蛋白为抗原免疫BALB/c(?)、鼠,经过细胞融合和筛选制备出2株单克隆抗体(1A5和5F7),以此2株抗体作为基础,建立了一套适用于CP4-EPSPS转基因大豆的双抗体夹心ELISA检测法,本文主要研究结果如下: 1.成功的构建了工程菌Rossetta/pET-28a-CP4,获得了重组CP4-EPSPS蛋白,经鉴定,该重组蛋白具有良好的抗原性。 2.成功的制备了抗CP4-EPSPS蛋白单克隆抗体1A5和5F7。其抗体亚型均为IgG1,相对亲和力均低于0.1μg/mL。此2株抗体具有良好的特异性,且识别不同的抗原表位。 3.成功的建立了适用于CP4-EPSPS转基因大豆的双抗体夹心ELISA检测法,通过抗体配对实验、矩阵滴定实验、单因素分析和正交实验分析,最终确定了5F7和HRP-1A5分别作为包被抗体和检测抗体、最佳工作浓度分别为1:2000和1:4000、包被抗体最佳孵育时间为4℃过夜、抗原最佳孵育时间为40min、检测抗体最佳孵育时间为40min。该检测法检测灵敏度为0.01μg/mL。 4.经验证,该检测法不仅适用于CP4-EPSPS转基因大豆的检测,对于CP4-EPSPS转基因玉米同样有效,由此推测,该检测法亦可用于其他CP4-EPSPS转基因作物检测。 本研究建立的检测法具有灵敏度高、操作简单、成本低等优点,不仅适于基层推广应用,也为试剂盒和试纸条等产品的研发提供了参考。


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