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人成纤维细胞生长因子8b原核表达及产物的纯化研究

黄鹏煌  
【摘要】:成纤维细胞生长因子8b (Fibroblast Growth Factor, FGF8b)在生长因子中与调节内分泌癌的发生和发展相关联,是一个有潜在临床应用价值的候选分子,为了满足重组人FGF8b的研发需要,论文采用分子克隆的方法构建了以包涵体形式表达FGF8b的重组大肠杆菌,并初步摸索出包涵体蛋白的纯化和复性工艺条件,通过Western blot和MTT法鉴定了FGF8b的生物化学特征和促增殖活性,表明利用包涵体复性技术初步得到了具有活性的蛋白,为后续研发进程奠定了基础。首先将密码子优化后的序列进行合成,再将合成的FGF8b基因连接到表达载体pET-3a中。最终构建原核表达载体pET-3a-FGF8b,并转化到BL21(DE3)pLysS表达宿主中,利用IPTG诱导表达,筛选出FGF8b高表达菌株,并经过连续传代50代,考察质粒的丢失率为1%且重组菌的形态特征无明显差异;不同代次酶切得到的目的片段大小与预期相一致,表明插入的目的基因未丢失;原代与传代的表达水平无明显差异,表明了菌株表达的稳定。通过诱导时机、诱导温度、诱导时间以及诱导剂浓度等条件进行表达条件优化。优化后诱导时机为OD600为0.6~0.8时、IPTG浓度为0.3mmol/L、诱导时间4~5小时、培养温度为37℃,目的蛋白的表达量为20%左右,包涵体形式表达。通过包涵体的洗涤对包涵体进行预处理,处理后目的蛋白的量为50%左右,在一定程度上提高了目的蛋白的纯度。采用变性后的蛋白通过CM阳离子交换层析纯化,纯化后纯度为90%以上。采用透析复性法,考察含氧化还原体系与非氧化还原体系的复性效果对比,最后通过Western blot和MTT法鉴定FGF8b的生物化学特征和促增殖活性,ED50约为50ng/mL。


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