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牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及对喹诺酮类抗生素耐药机制研究

孔令聪  
【摘要】:牛源多杀性巴氏杆菌(Pasteurella mutocida, Pm)是引起牛呼吸系统疾病(Bovine respiratory disease, BRD)的主要病原,其引发的疾病以肺炎为主要示病特征。以前在我国引起BRD的主要病原是牛源荚膜血清B型Pm,但自2008年以来,相继有文献报道从患肺炎的病牛组织中分离到牛源荚膜血清A型Pm,其较差的菌间交互免疫导致了对抗生素治疗的依赖,但随着兽医临床对抗生素的不合理使用,使Pm逐渐出现了耐药株,不仅给控制和治疗疾病带来困难,而且加剧了抗生素在牛体内的残留,严重的危害动物食品安全。 1.牛源荚膜血清A型Pm的分离、鉴定及耐药情况分析 对吉林省部分爆发牛BRD的牛场进行病料采集,在对分离菌进行纯化培养、形态观察、生化鉴定的基础上,进一步用PCR方法对其进行鉴定和荚膜分型,共获得8株牛源荚膜血清A型Pm。采用琼脂二倍稀释法测定了8株牛源荚膜血清A型Pm对9种临床常用抗生素的MIC值,结果显示,所有菌株均对丁胺卡那、新诺明耐药(MIC≥64μg/mL);部分菌株(Pm-cys、Pm-hy、Pm-wh、Pm-b)对链霉素和替米考星高度耐药(MIC≥512μg/mL),此外,所分离菌株均对头孢曲松较敏感(MIC≤0.5μg/mL),除Pm-hy、Pm-wh外,所有菌株对环丙沙星和氟苯尼考较敏感(MIC≤0.5μg/mL)。 2.体外诱导牛源荚膜血清A型Pm喹诺酮耐药靶位突变分析 以临床分离对环丙沙星和恩诺沙星敏感的牛源荚膜血清A型Pm为研究对象,分别采用体外连续诱导法及一步突变株筛选法诱导出对环丙沙星和恩诺沙星耐药的菌株,并用CLSI推荐的微量稀释法测定环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星对亲本株和诱导株的MICs,分析其是否对不同诱导药物存在交叉耐药情况。进一步采用PCR和基因测序的方法分析亲本株和诱导株DNA回旋酶和拓扑异构酶Ⅳ喹诺酮耐药决定区(QRDR)碱基突变及氨基酸置换的情况。结果显示,浓度递增法和一步突变株筛选法均可诱导牛源荚膜血清A型Pm对环丙沙星和恩诺沙星产生耐药,且不同喹诺酮类抗生素诱导株存在交叉耐药情况。恩诺沙星和环丙沙星诱导株在DNA回旋酶和拓扑异构酶IVQRDR基因突变和氨基酸置换位点较为相似,其均存在gyrA基因QRDR的Asp87Asn、Ser83Ile和Ala84Pro的氨基酸置换,parC基因QRDR的Glu84Lys的氨基酸置换,与部分文献报道一致。在诱导株中还发现了一些未曾报道的氨基酸位点突变,如parC基因QRDR的Gly78Asp的氨基酸置换,gyrB基因QRDR的Ala418Val、 Asp402Asn的氨基酸置换。同时,对一步突变株氨基酸置换结果分析显示,牛源荚膜血清A型Pm gyrA基因QRDR83位和87位的单点突变不会造成菌株的高度耐药。 3.诱导耐药牛源荚膜血清A型Pm主动外排系统及耐药质粒的初步确证 采用微量稀释法测定CCCP和利血平对亲本株和诱导耐药株对环丙沙星MICs的耐药性逆转,分别对ATP水解所释放自由能驱动的外排系统和质子偶联交换产生的质子驱动力(PMF)所介导的次级药物转运系统的存在进行确证。进一步对亲本株和诱导株体内环丙沙星蓄积和外排进行监测。同时,对质粒携带的耐药基因进行检测。结果显示,CCCP对亲本株和诱导耐药株都有不同程度的耐药性逆转,但通过体内药物蓄积及外排试验证明,诱导耐药株对环丙沙星的外排能力比亲本株强,且对环丙沙星的体内蓄积却明显弱于亲本株。此外,所分离菌株均携带有15000bp左右质粒,经过质粒携带的耐药基因的确证显示,只有Pm-xz和Pm-b株扩增出了与aac(6')-Ib基因片度大小相符的片段,但经测序后发现其未发生碱基突变形成喹诺酮修饰酶基因(aac(6')-Ib-cr)。


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