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肉碱对鲤鱼幼鱼脂肪酸代谢调控作用的研究

董婧  
【摘要】:鱼类脂类代谢调控已成为营养学的一个研究热点。脂肪酸是鱼类机体组织主要能量来源,而肉碱对脂肪酸的正常代谢极为重要。线粒体外膜上被活化的长链脂肪酸不能自由通过线粒体内膜进行β-氧化,只能通过肉碱介导进入,该过程是线粒体内脂肪酸氧化的一个重要调节位点。肉碱棕榈酰转移酶I(CPT I)被认为是线粒体脂肪酸氧化过程中的关键调节酶。肉碱和肉碱棕榈酰转移酶I在线粒体脂肪酸氧化过程中的相互作用对调控脂肪酸代谢的研究至关重要。但是目前已知的鱼类CPT I基因序列非常少,鱼类肉碱水平与CPT I活性的相互关系尚不清楚,关于肉碱对水产动物CPT I基因表达水平的影响目前尚未见报道。有关肉碱对鱼类脂肪酸代谢相关酶基因调控关系的研究较少,需要进一步在分子水平上进行深入研究。 本研究以我国最具代表性的养殖鱼类鲤鱼为材料,从表观性状、组织表现、细胞调控等不同层面,系统研究肉碱调控鲤鱼幼鱼的生长、体组成、血浆生化指标、组织的脂肪酸组成变化、肉碱含量、脂肪酸代谢相关酶活性及细胞内脂肪酸代谢信号分子的变化,探讨肉碱作用下鲤鱼线粒体内肉碱对脂肪酸代谢的调控作用。 通过下列试验设计,经过系列试验,得到如下结果: (1)通过在基础饲料中分别添加0,50,100,150,200和400mg/kg L-肉碱,饲喂平均体重(2.5±0.5)g的鲤鱼(Cyprinus carpio)幼鱼60d,测定增重率、特定生长率、饲料系数、成活率、背肌营养组成和游离肉碱水平、血浆中甘油三酯、总胆固醇、白蛋白、尿素氮等指标,研究肉碱对鲤鱼幼鱼生长性能、生化组成及血浆生化指标的影响,为饲料中肉碱的添加提供理论依据。 结果显示肉碱的添加量为200mg/kg时,鲤鱼幼鱼的平均末尾重、增重率和特定生长率显著提高,饲料系数显著降低(P<0.05),成活率无显著差异(P>0.05);随肉碱添加量的增加,背肌粗蛋白含量呈增加趋势,粗脂肪含量呈下降趋势。添加200mg/kg时,与对照组相比,粗蛋白增加了11.18%,粗脂肪降低了12.65%,差异均显著(P<0.05),但与添加400mg/kg试验组比,无显著差异(P>0.05);饲料中添加肉碱可降低血浆中总胆固醇、甘油三酯、尿素氮的含量,增加白蛋白含量。添加150mg/kg肉碱时,总胆固醇含量最低,与对照组比降低了36.08%,差异显著(P<0.05),而添加50mg/kg肉碱时,与对照组比较,甘油三酯含量下降了50.28%,差异显著(P<0.05);随肉碱添加量增加,鲤鱼幼鱼血浆中尿素氮含量显著下降,白蛋白含量显著增加(P<0.05)。当添加量为200mg/kg时,尿素氮含量最低,白蛋白含量最高,分别为13.49mmol/L和9.12g/L,与对照组比较分别下降了17.49%和增加了32.56%,差异均显著(P<0.05),但各试验组间差异不显著(P>0.05)。当添加量为150,200,400mg/kg时,鲤鱼幼鱼背肌游离肉碱含量与对照组相比,差异显著,并且这三个处理组之间也差异显著(P<0.05)。说明鲤鱼幼鱼背肌中游离肉碱含量随肉碱添加量的增加而增加。研究表明,肉碱可促进鲤鱼幼鱼生长,显著增加组织中游离肉碱含量,显著降低组织与血浆中脂肪含量。建议鲤鱼幼鱼期肉碱最适添加量为200mg/kg。 (2)取鲤鱼背肌、肝胰脏样品,测定其脂肪酸组成。研究肉碱对鲤鱼背肌、肝胰脏脂肪酸组成的影响。结果发现肉碱对鲤鱼背肌、肝胰脏脂肪酸组成有显著影响(P<0.05),随饲料中L-肉碱添加量的增加,∑SFA和∑MUFA脂肪酸含量显著升高(P<0.05),∑PUFA、EPA、DHA、∑n-3和∑n-6脂肪酸含量显著降低(P<0.05)。研究表明在本试验条件下,肉碱添加量为150mg/kg时,显著影响鲤鱼幼鱼背肌、肝胰脏脂肪酸组成,肉碱的添加使鲤鱼幼鱼背肌中PUFA、EPA、DHA的利用大于合成,脂肪酸代谢增强,丰富了肉碱对淡水杂食性鱼类脂肪酸代谢理论。 (3)取鲤鱼幼鱼肝胰脏样品,测定脂肪酸代谢相关酶活性。研究肉碱对鲤鱼幼鱼脂肪酸代谢相关酶活性的影响。结果显示当添加150mg/kg肉碱时能显著降低肝胰脏中FAS活性,显著增加了脂蛋白脂酶、肝脂酶活性、总脂酶和CPT I活性。结果表明饲料中添加适量肉碱使脂肪酸代谢过程中的脂肪分解酶活性和CPT I活性升高,促进了线粒体脂肪酸氧化,脂肪酸代谢增强,肉碱可通过调节脂肪酸代谢相关酶的活性,来维持机体脂肪酸代谢的动态平衡,进一步探究肉碱对脂肪酸代谢调控作用。 (4)提取鲤鱼背肌总RNA,采用同源克隆方法克隆鲤鱼CPT I基因部分序列,对其序列进行比较和分析。首次获得了鲤鱼CPT I基因的部分cDNA序列(GenBank注册号为JQ361077),并进行了序列同源性分析:序列长度为857bp,试验获得的片段同GenBank上发表的斑马鱼和虹鳟的CPT I基因序列进行比对分析,其同源性分别为89%和79%。表明所得CPT I基因片段有较高的保守性。本试验获得的鲤鱼CPT I基因与斑马鱼等鱼类的CPT I基因聚类在一起,随后共同聚类为CPT IB群,推测其为CPT IB亚型。研究结果为进一步探讨CPT I的功能、脂肪酸跨膜转运及代谢调控的分子机制奠定基础。 (5)提取鲤鱼肝胰脏、心脏、红肌、白肌、肾脏和肠6个组织总RNA,采用实时定量PCR(Real-time PCR)方法,检测了CPT I基因在鲤鱼不同组织的表达情况;此外饲养试验结束后取鲤鱼背部白肌样品,采用Real-time PCR方法测定CPT I基因mRNA表达水平的变化。分析CPT I基因在不同组织的表达水平,研究肉碱对鲤鱼背肌CPT I基因表达的影响。结果发现该基因在检测的肝脏、心脏、红肌、白肌、肾脏和肠6个组织中均有表达,心脏表达最高,背部红肌和肾脏次之,背部白肌、肠和肝脏表达量最低;CPT I基因在鲤鱼饲喂L-肉碱浓度为150mg/kg表达丰度最高,是对照组的4倍。研究表明该基因在鲤鱼高能量需求及线粒体丰富的组织中表达水平较高,并其表达受到饲料中肉碱添加量的调控。 综上所述,随肉碱添加量的增加,肌肉组织中游离肉碱的含量增多、CPT I酶的活性及基因的mRNA表达量升高,长链脂肪酸代谢增强,表明CPT I基因mRNA表达量与其活性的改变是平行的,作为酶作用底物的肉碱增加了,能够促进CPT I基因转录水平的上调,使酶活性增加,将更多的长链脂肪酸转入线粒体内进行β-氧化。本研究为阐明肉碱对脂肪酸代谢调控作用提供了理论依据,丰富了淡水鱼类脂肪酸代谢调控理论,指导鱼类养殖业对肉碱的合理利用,为配合饲料的研发和应用提供新的思路及技术支持,具有重要理论和指导意义。


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