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大豆凝集素和脂肪氧化酶双价RNAi表达载体的构建及其在大豆中的遗传转化

张学明  
【摘要】:大豆(Glycine max)作为我国乃至世界上重要的经济作物、油料作物之一,是人类食物主要的植物蛋白来源,其氨基酸含量均衡,具有极高的营养价值。但是,大豆中也存在许多营养抑制因子,严重的影响大豆的品质,降低了大豆的营养价值。大豆脂肪氧化酶和大豆凝集素就是主要的两种抗营养因子。大豆脂肪氧化酶降低了大豆的含油量,其催化不饱和脂肪酸进行氧化产生一些具有异味的小分子,使豆制品产生豆腥味。大豆凝集素具有典型的豆科植物凝集素的四聚体结构,能够凝集动物红细胞和其他细胞,破坏小肠正常结构,对人和动物的消化吸收、免疫系统、内脏系统产生不利影响,严重影响了大豆蛋白质的利用效率。所以,如何去除或降低大豆脂肪氧化酶和大豆凝集素的含量已成为当今育种的首要任务。目前使用传统育种方法来改良大豆的品质受制于育种周期长、种子选育成本高、品种资源有限、遗传基础资源狭窄等一系列问题。运用分子育种可以有目标的对作物进行定向的改造,并且可以从表现型到分子等多个层面进行操作,这样可以大大的提高育种的效率,节约育种成本。 本实验应用RNAi原理,利用本实验室的基础表达载体pC1301-LoxRi和pCAMBIA3301-KTi-SBA,通过酶切获得Lox目的片段构建成以除草剂bar为筛选标记、种子特异性启动子P7P启动SBA和Lox双干扰的pCAMBIA3301-SBA-Lox植物表达载体,并通过农杆菌介导法与花粉管通道法转化至高油高产大豆品种“吉农28”中,对转化植株进行PCR、Southern杂交和实时定量PCR分子水平检测。取得如下结果:(1)本研究利用植物基础表达载体pC1301-LoxRi和pCAMBIA3301-KTi-SBA,通过酶切等方法成功构建了带有SBA和Lox双干扰构件的表达载体pCAMBIA3301-SBA-Lox。(2)使用农杆菌介导法将含有pCAMBIA3301-SBA-Lox双干扰表达载体转化到受体大豆“吉农28”,获得T0代抗性植株6株,收获T0代籽粒73粒,对T1代植株进行PCR检测获得23株阳性植株;利用花粉管通道法获得T0代种子532粒,将其播种于田间,经检测获得T1代阳性植株14株,T2代阳性植株27株。(3) Southern杂交检测结果表明,外源基因bar目的片段以单拷贝形式整合到大豆“吉农28”品种的基因组中。(4)实时定量PCR结果显示,转基因植株SBA基因和Lox基因在籽粒中的mRNA表达量相比对照受体植株均明显降低,通过农杆菌介导法获得的转化植株中SBA基因表达量降低了35.9%-47.2%,在幼嫩叶片中的表达量相比对照植株变化不大,分别为7.4%-9.3%和8.9%-12.5%;通过花粉管通道法获得的转化植株中SBA基因表达量降低了24.0%-47.5%。而Lox基因的表达量分别降低了32.8%-56.1%和51.7%-59.1%,在幼嫩叶片中的表达量相比对照植株变化不大,分别为2.3%-13.7%和2.3%-9.1%。


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