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L-肉碱对H_2O_2诱导氧化应激的两种鱼细胞抗氧化功能影响及其机理研究

王秋举  
【摘要】:活性氧(ROS)是一类具有强氧化力的含氧分子、离子和自由基。氧化应激是指ROS过多积累,不能被动物机体抗氧化防御系统及时清除,导致机体氧化还原不平衡的状态。氧化应激不仅危害人类健康还给水产养殖业造成巨大经济损失。L-肉碱(LC)作为营养添加剂,虽然其抗氧化作用在哺乳动物上已初步展开研究,但对鱼类抗氧化功能的影响却鲜有报道,其抗氧化机制也尚未明确。因此,本研究拟定在体外条件下,以对氧化应激敏感的肌肉和卵巢组织为研究对象,即胖头鱥肌肉细胞系(fathead minnow muscle cell line,FHM)和草鱼卵巢细胞系(Ctenopharyngodon idellus ovary cell line,GCO),以常用氧化应激诱导剂H2O2建立氧化应激细胞模型,采用流式细胞术、荧光定量PCR和免疫细胞化学等技术,逐步研究L-肉碱对氧化应激细胞模型的生长状态、ROS及凋亡水平、抗氧化能力及抗氧化酶mRNA相对表达量影响,进一步研究L-肉碱对控制抗氧化酶基因表达的信号通路Keap1-Nrf2-ARE的关键核转录因子Nrf2的调节作用,从而证明L-肉碱对FHM和GCO细胞抗氧化功能的促进作用。本研究为L-肉碱抗氧化作用机理的揭示及作为抗氧化剂应用于生产实践奠定理论基础,及L-肉碱作为药物预防相关疾病的发生提供理论参考。本研究共包括五部分试验,结果如下:(1)采用细胞活力和细胞存活率两个指标为标准,以MTT法测定细胞活力和台盼蓝染色法计算细胞存活率,检测H2O2对FHM和GCO两种鱼细胞的细胞活力和细胞存活率的影响,筛选出对细胞活力和细胞存活率抑制水平均为50%左右的H2O2刺激浓度及时间。在此基础上,采用流式细胞仪测定细胞中ROS及凋亡水平变化,以生物化学法测定细胞中MDA、GSH水平及SOD、CAT、GPx和γ-GCS活性变化,判断所筛选H2O2浓度及时间是否能诱导FHM和GCO细胞氧化应激。结果显示,H2O2对FHM和GCO两种鱼细胞的细胞活力和细胞存活率影响呈现时间-剂量依赖效应,1 mM H2O2刺激FHM 1h使细胞活力降低为45%,及存活率降低为55%;同样的,2.5 mM H2O2刺激GCO 1h使细胞活力降低为60%,及存活率降低为45%。1和2.5 mM H2O2分别显著增加FHM和GCO细胞ROS和细胞凋亡水平和细胞MDA含量(p0.05),显著降低细胞SOD、GPx和γ-GCS活性(p0.05)。通过对细胞ROS、细胞凋亡和主要抗氧化酶检验后,在本试验条件下,1 mM H2O2刺激FHM 1h,2.5 mM H2O2刺激GCO 1h能分别成功诱导FHM和GCO氧化损伤。(2)0.1-1mml-肉碱作用fhm细胞6和12h后,细胞活力明显高于对照组(p0.05),0.01-1mml-肉碱显著提高gco细胞活力(p0.05)。与h2o2组相比,0.001-1mml-肉碱显著提高氧化应激fhm细胞活力(p0.05),相似的,0.1-5mml-肉碱显著提高氧化应激gco细胞活力(p0.05)。0.1-1mml-肉碱显著降低fhm细胞ros水平(p0.05),0.5和1l-肉碱显著降低gco细胞ros水平(p0.05)。与h2o2组相比,0.5mml-肉碱显著降低了氧化应激fhm和gco细胞凋亡和坏死(p0.05)。(3)与h2o2组相比,0.1-1mml-肉碱预处理组均显著降低了fhm和gco细胞的mda含量(p0.05);l-肉碱预处理组fhm总gsh含量均有所升高,其中1mml-肉碱预处理组总gsh含量达到显著水平(p0.05),0.1-1mml-肉碱预处理均显著升高gco细胞总gsh含量(p0.05);与h2o2组相比,l-肉碱预处理组fhm细胞总sod活性均有提高,其中0.1mml-肉碱预处理组总sod活性达到显著水平(p0.05),0.5和1mml-肉碱预处理显著提高了gco细胞总sod活性(p0.05);0.5和1mml-肉碱预处理组fhm细胞cat活性显著高于1mmh2o2组(p0.05),0.5mml-肉碱预处理组gco细胞cat活性显著高于2.5mmh2o2组(p0.05);0.1-1mml-肉碱预处理组fhm细胞gpx活性显著高于1mmh2o2组(p0.05),而l-肉碱预处理对gco细胞gpx活性无显著影响(p0.05);与h2o2组相比,0.1mml-肉碱预处理显著升高了fhm细胞γ-gcs活性(p0.05),0.5和1mml-肉碱预处理显著升高了gco细胞γ-gcs活性(p0.05)。(4)l-肉碱单独处理两种细胞,cuzn-sodmrna相对表达量显著升高(p0.05),gco细胞gpx和gclc两种酶mrna相对表达量显著升高(p0.05),而对fhm细胞无显著影响(p0.05)。h2o2对fhm(1.0mm)和gco(2.5mm)刺激显著上调两种细胞cuzn-sodmrna相对表达量(p0.05),显著下调两种细胞gclcmrna相对表达量(p0.05),而对cat和gpx无显著性影响(p0.05)。在h2o2诱导状态下,l-肉碱(0.1-1mm)预处理显著提高fhm(6h)和gco(12h)细胞gclcmrna相对表达量(p0.05),0.5mml-肉碱预处理组gco细胞cat和gpxmrna相对表达量显著升高(p0.05),l-肉碱预处理一定程度上调了fhm细胞cuzn-sod、cat和gpxmrna相对表达量。(5)h2o2组fhm细胞nrf2mrna相对表达量与对照组无显著差别(p0.05);h2o2组gco细胞nrf2mrna相对表达量显著降低(p0.05)。0.5mml-肉碱在正常和氧化应激条件下均能显著的提高细胞中nrf2mrna相对表达量(p0.05)。通过免疫细胞化学结果可知,在氧化应激状态下,l-肉碱能明显的促进细胞Nrf2的核移位。综合以上结果可知,H2O2可以降低FHM和GCO细胞活力、存活率及抗氧化功能,诱导细胞氧化应激;而适宜浓度的L-肉碱能提高H2O2诱导氧化应激FHM和GCO细胞活力,抑制细胞凋亡和ROS的产生、并能明显的提高细胞抗氧化功能;同时,适宜浓度的L-肉碱能上调H2O2诱导氧化应激FHM和GCO细胞抗氧化酶及核转录因子Nrf2 mRNA的相对表达量,促进细胞Nrf2核移位。总之,本研究证明,L-肉碱能促进FHM和GCO细胞生长,提高细胞的抗氧化功能,L-肉碱对FHM和GCO细胞核转录因子Nrf2具有调节作用,其抗氧化机理与Nrf2-Keap1-ARE信号通路相关。在本试验条件下,L-肉碱添加0.1-1 mM,作用时间6-12h可有效保护FHM和GCO细胞免受H2O2诱导的氧化损伤。


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