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布鲁氏菌L7/L12、Omp31及其融合基因真核表达载体的构建及免疫原性研究

李仲乐  
【摘要】:布鲁氏菌病(Brucellosis)是一种最常见的细菌性传染病。该病在全球范围内感染200多种家禽、家畜、野生动物及人类。无论是人还是动物的布鲁氏菌病,世界上160个国家和地区均有散发流行,造成了巨大的经济损失。疫苗接种是控制布鲁氏菌病的有效措施。目前常用的畜用的疫苗有,减毒活疫苗流产19号弱毒活疫苗、猪2号弱毒活疫苗、羊马耳他5号(M)弱毒活疫苗、羊马耳他Rev-1弱毒活疫苗等。这些疫苗均具有较好的保护效果,稳定性强,接种途径简单。弱毒疫苗可能会出现“返祖”情况,使用时存在一定的安全问题,且不能区分是由疫苗接种还是自然感染造成的疾病发生,为了克服现有疫苗的不足,新型疫苗的应运而生。因此,本研究选择布鲁氏菌L7/L12和Omp31基因,并且二者融合构建核酸疫苗,以其对新型疫苗的研制奠定实验基础。(1)布鲁氏菌L7/L12、Omp31和L7/L12-Omp31融合基因真核表达载体的构建本实验以猪型布鲁氏菌S2基因组为模板,扩增L7/L12和Omp31基因,利用重叠延伸PCR方法扩增L7/L12-Omp31融合基因,分别与克隆载体pGEM-T连接,将鉴定正确的质粒分别与pVAX1载体酶切后连接,构建真核表达质粒pVAX1-L7/L12、pVAX1-Omp31和pVAX1-L7/L12-Omp31。(2)布鲁氏菌L7/L12、Omp31和L7/L12-Omp31融合基因的表达将构建真核表达载体的pVAX1-L7/L12、pVAX1-Omp31、pVAX1-L7/L12-Omp31通过脂质体介导转染Vero细胞,48h后进行间接免疫荧光和Western blotting检测,结果显示L7/L12、Omp31和L7/L12-Omp31融合基因在Vero细胞中进行了表达,表达的目的蛋白具有良好的反应原性。(3)布鲁氏菌L7/L12、Omp31和L7/L12-Omp31融合基因表达产物免疫原性分析大量提取质粒pVAX1-L7/L12、pVAX1-Omp31、pVAX1-L7/L12-Omp31免疫昆明小鼠,通过检测免疫小鼠的抗体水平,T淋巴细胞亚群含量和细胞因子水平,综合评价小鼠的体液免疫和细胞免疫应答。三免后用间接ELISA检测小鼠血清中抗体水平,实验组小鼠均能产生特异性抗布鲁氏菌的抗体;CCK8检测ConA和S2刺激免疫后小鼠脾脏淋巴细胞增殖,S2特异性刺激指数高于ConA非特异性的刺激指数;流式细胞仪检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分类情况,实验组的CD4+/CD8+比值要小于PBS组,表明真核表达载体诱导小鼠细胞免疫以CD8+介导的免疫反应为主。用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附实验检测免疫小鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12等细胞因子的分泌水平,小鼠血清中的IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12细胞因子水平都有一定的上升,但是IL-4数值相比于其他细胞因子数值小得多。表明真核表达载体免疫小鼠能够诱导小鼠体内产生Th1和Th2细胞型免疫应答,但以Th1型免疫应答为主。本研究将构建的pVAX1-L7/L12、pVAX1-Omp31、pVAX1-L7/L12-Omp31作为核酸疫苗免疫小鼠,综合分析体液免疫和细胞免疫表明了L7/L12-Omp31融合基因真核表达载体的免疫效果好于单个基因的DNA疫苗,因此,融合基因可以作为研制布鲁氏菌亚单位疫苗的一个新的潜在候选抗原。


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