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牛A型多杀性巴氏杆菌耐药性分析及对部分常用药物耐药机制研究

孔令聪  
【摘要】:牛A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是引起牛呼吸系统疾病(Bovinere spiratory disease complex,BRDC)的主要病原体之一,已呈世界性流行和分布,给畜牧养殖业造成了严重的经济损失。该病原于2008年首次在我国流行,多发于经长途运输的育肥架子牛中并导致了较高的发病率和死亡率,时至今日,该病原引发的疾病并未减缓,给我国“北牛南调,西牛东运”的肉牛育肥模式提出了挑战。牛A型Pm引发的疾病主要依赖抗生素的治疗,但随着药物压力的长时间存在,该病原已出现了耐药菌。2012年,在德国分离到一株对12种常用抗菌药物均耐药的高度耐药菌,为对该病原进行耐药性及耐药机制研究敲响了警钟。本研究首次对经东北三省进行“北牛南调”的育肥架子牛进行跟踪监测,结果发现,目前从我国分离的牛A型Pm对喹诺酮类和大环内酯类药物存在耐药性风险,进而在基因组及转录组层面进行牛A型Pm对喹诺酮类药物和大环内酯类药物的耐药性分子机制研究,主要试验结果如下:1.牛A型Pm的耐药性分析及多重耐药菌基因组的高通量测序本研究首次对经东北三省进行“北牛南调”的育肥架子牛进行跟踪监测,在明确牛A型Pm的感染情况的基础上,对分离菌进行了常用药物的敏感性检测,进而对所分离的耐药菌进行全基因组高通量测序,比较其与国外耐药菌之间的差异,并对其耐药菌克隆传播风险进行评估。结果显示,在我国六个省份的部分育肥牛养殖场分离到23株牛A型Pm,其已对新诺明、磺胺氯氰钠高度耐药;部分菌株对丁胺卡那、庆大霉素耐药;部分菌株已逐渐对临床常用的喹诺酮类药物和大环内酯类药物产生耐药性;分离菌均对氟苯尼考相对敏感。多重耐药牛A型Pm基因组高通量测序结果显示,其基因组上存在多个耐药基因,可分别介导对甲氧苄啶、万古霉素、春日霉素、链阳霉素耐药;基因组上存在3个编码药物外排蛋白的基因,可分别编码对大环内酯类、喹诺酮类及青霉素/喹诺酮类/四环素类药物耐药;基因组上还存在有Ⅰ类耐药整合子,其耐药整合子可变区存在完整的氨基糖苷乙酰转移酶编码序列。此外,23株临床分离菌经脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field Gel Electrophoresis,PFGE)分型结果显示,共含有7个不同的PFGE图谱,表现为独特性,且部分PFGE谱型不相关,证明部分菌有随着育肥牛的异地运输而发生克隆传播的风险。2.牛A型Pm喹诺酮类和大环内酯类药物耐药菌靶位突变分析针对上述临床实际,本研究牛A型Pm对喹诺酮类药物进行了防耐药变异浓度测定,对一步突变菌和体外高度耐药菌进行诱导,并采用PCR技术对牛A型pm的喹诺酮类药物和大环内酯类药物靶位进行了突变分析,进一步采用同源建模和分子对接技术对靶位突变后相关作用力的改变进行了研究。结果显示,牛a型pm促旋酶a亚基(gyra)喹诺酮类药物耐药决定区(quinolone-resistantdeterminingregion,qrdr)发生单点突变的菌株存在耐药性风险,其防耐药突变选择浓度(mutantpreventionconcentration,mpc)较高,容易筛选到一步突变耐药菌。其gyraqrdr83位(相对于大肠杆菌位点)的丝氨酸置换成了异亮氨酸和拓扑异构酶c亚基(parc)qrdr84位的谷氨酸置换成赖氨酸,可赋予该菌对喹诺酮类药物的高度耐药性。其中,突变菌gyraqrdr83位的丝氨酸被异亮氨酸置换后,导致环丙沙星与丝氨酸结合的双氢键作用消失;突变菌parcqrdr80位和84位氨基酸发生突变后,导致环丙沙星与丝氨酸(80位)和谷氨酸(84位)结合的氢键作用消失,从而降低了该菌对药物的敏感性。此外,牛a型pm均含有6个23srrna操纵子,其中5个操纵子的编码方向为正向,1个操纵子的编码方向为反向,各操纵子序列具有高度同源性,耐药菌靶位突变与澳洲分离菌相似,其23srrna2059位的碱基置换(a→g)介导了牛a型pm对大环内酯类药物的高度耐药。3.亚抑菌浓度作用下药物外排相关基因表达量分析首先,采用质子泵能量抑制剂氰氯苯腙(carbonylcynidem-chlorophenylhydrazone,cccp)和atp能量抑制剂利血平对药物外排系统在牛a型pm耐药中所起的作用进行初步检测,结果显示,在加入亚抑菌浓度质子泵能量抑制剂cccp后,喹诺酮类耐药菌和大环内酯类耐药菌最小抑菌浓度均发生了下降,证明药物外排系统在一定程度上参与了牛a型pm的耐药,进而以耐药菌基因组高通量测序筛选到的3个编码药物外排基因为基础,采用实时荧光定量pcr检测了3个基因在有药物压力和无药物压力作用下的相对表达量,并采用生物质谱多反应监测技术(multiplereactionmonitoring,mrm)对3个蛋白在药物压力作用下的蛋白表达量进行了定量。结果发现,在亚抑菌浓度的恩诺沙星作用下,牛a型pm喹诺酮类耐药菌mexv在基因水平和蛋白水平均显著高于敏感菌,证明mexv可能在一定程度上介导了牛a型pm对喹诺酮类药物的耐药。4.亚抑菌浓度药物作用下恩诺沙星、替米考星耐药菌转录谱分析及耐药相关代谢通路筛选为了对上述耐药靶位和耐药基因的变化进行更深入的分析,本研究采用转录组测序(rnasequencin,rna-seq)的方法分别对亚抑菌浓度恩诺沙星和亚抑菌浓度替米考星作用下的菌株进行了转录谱分析。结果显示,牛a型pm喹诺酮类药物耐药菌和替米考星耐药菌与敏感菌相比,分别存在533个、292个差异表达基因。对差异表达基因进行了功能注释和相关代谢通路的绘制,发现在亚抑菌浓度恩诺沙星和替米考星作用下牛A型Pm耐药菌的SOS应答反应通路中部分基因和糖酵解相关代谢通路的部分基因分别发生了显著上调。综上所述,从我国6个省份分离的牛A型Pm对常用药物敏感性已下降,且耐药性有随育肥牛的转运而发生转移的风险。多重耐药菌基因组中存在多个耐药基因,但耐药基因携带情况与德国分离菌存在较大差异,其整合子可变区耐药基因盒较单一,仅存在氨基糖苷乙酰转移酶。喹诺酮类药物耐药菌发生了耐药靶位的突变和药物外排蛋白表达水平的变化,大环内酯类药物耐药菌主要发生了药物靶位的突变。恩诺沙星和替米考星都诱导牛A型Pm发生了SOS应答反应,且与其他源性细菌SOS应答反应调节基因有较大差别,其lexA、ssB、recO、ruvA等基因发生了显著上调,同时耐药菌中糖酵解等代谢通路的部分基因也发生了显著上调。


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