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辽宁绒山羊与乾华肉用美利奴羊皮肤毛囊miRNA筛选及靶基因验证

张桂山  
【摘要】:辽宁绒山羊属绒肉兼用型品种,是我国产绒量最高的优良品种,遗传性能稳定,种用价值极高,不但产绒量高,而且绒纤维伸直长度可达10 cm,粗细度适中,纤维直径平均为15μm左右。乾华肉用美利奴羊是吉林省新选育出来的肉毛兼用型新品种,不但具有良好的产肉性能,而且羊毛纤维直径也在20.47-21.43μm之间(即品质支数在66支的范围内),因此也是优质的细毛羊品种。miRNA是一类19-25nt的单链非编码小分子RNA,是大量细胞进程的必需调节器。毛囊是皮肤重要的附属可再生器官,控制着毛发的生长,而且具有自我更新和周期性生长变化的特点。为了明确miRNA对皮肤毛囊发育的调节作用并探究可能的作用机制,本研究利用高通量测序技术筛选了皮肤毛囊不同发育时期的小RNA,并构建了小RNA文库,同时筛选了皮肤毛囊不同发育时期差异表达的miRNA;利用生物信息学方法分析预测了差异表达miRNA:miR-1298-5p、miR-1-3p的靶基因,并结合相关文献确定候选靶基因;利用荧光定量PCR技术从核酸水平水平揭示miRNA及候选靶基因对皮肤毛囊发育作用的影响;利用Western blot技术揭示候选靶基因对皮肤毛囊发育作用的影响,从而进一步揭示miRNA及候选靶基因对皮肤毛囊周期性发育的作用调节机制。为了进一步揭示miRNA对其候选靶基因的调控作用,本研究采用双荧光素酶报告系统实验利用双荧光素酶活性的变化明确miRNA对其靶基因的靶向调控作用,从而进一步明确miRNA对皮肤毛囊发育作用的可能调控机制,为进一步揭示毛囊周期性发育作用机制提供重要的研究依据。主要研究结果如下:1.构建了辽宁绒山羊和乾华肉用美利奴羊皮肤毛囊生长期、退行期和休止期的小RNA文库,HiSeq测序结果经过过滤获得纯净reads数分别为8596054、11039308和10478621,10279515、11712275和10926258,6个文库小RNA长度分布一致,22 nt小RNA最多,其次是21 nt和23 nt。2.辽宁绒山羊与乾华肉用美利奴羊共获得了1616个成熟miRNA,其中1397个保守miRNA,219个新mi RNA,大大丰富了羊属miRNA数据库。辽宁绒山羊和乾华肉用美利奴羊皮肤毛囊生长期、退行期和休止期特有的miRNA数分别为21个、23个和26个,15个、30个和27个。3.通过荧光定量PCR测定了10个mi RNA在毛囊生长期、退行期和休止期的相对表达量,miRNA相对表达量结果趋势与高通量测序结果趋势基本一致,说明高通量测序结果准确。4.利用IDEG6软件进行差异表达miRNA分析,利用Targetscan v7.0、RNA22 v2.0和MiRanda(2010)三个靶基因预测软件对miR-1298-5p与mi R-1-3p的靶基因进行了预测分析,结合调控皮肤毛囊发育的相关信号通路(Wnt,TGF-β,Notch,SHH,MAPK,BMP,Jak-STAT和TNF)进行候选靶基因筛选,并最终确定TGFBR1、TGFBR2和FGF2为miR-1298-5p的候选靶基因,IGF1R和FGF14为mi R-1-3p的候选靶基因。5.荧光定量PCR分析结果:miR-1298-5p在辽宁绒山羊皮肤毛囊生长期低表达,退行期高表达,miR-1-3p生长期低表达,休止期高表达;mi R-1298-5p在乾华肉用美利奴羊皮肤毛囊退行期高表达,休止期低表达,miR-1-3p生长期低表达,休止期高表达;TGFBR1、TGFBR2、FGF2、IGF1R和FGF14五个候选靶基因mRNA在辽宁绒山羊与乾华肉用美利奴羊皮肤组织内均有表达。候选靶基因TGFBR1、TGFBR2和FGF2 mRNA在辽宁绒山羊皮肤毛囊生长期高表达,退行期低表达;TGFBR1、TGFBR2和FGF2 mRNA在乾华肉用美利奴羊皮肤毛囊退行期低表达,候选靶基因TGFBR1和FGF2 mRNA在休止期高表达,候选靶基因TGFBR2 mRNA在生长期高表达;候选靶基因IGF1R mRNA在辽宁绒山羊皮肤毛囊退行期低表达,休止期高表达,候选靶基因FGF14在生长期高表达,休止期低表达;候选靶基因IGF1R和FGF14 mRNA在乾华肉用美利奴羊皮肤毛囊生长期高表达,退行期低表达。6.Western blot分析候选靶基因蛋白相对表达量结果:TGFBR1、TGFBR2、FGF2、IGF1R和FGF14五个候选靶基因蛋白在辽宁绒山羊与乾华肉用美利奴羊皮肤组织内均有表达。候选靶基因TGFBR1、TGFBR2和FGF2蛋白在辽宁绒山羊皮肤毛囊生长期高表达,退行期低表达;TGFBR1、TGFBR2和FGF2蛋白在乾华肉用美利奴羊皮肤毛囊退行期低表达,候选靶基因TGFBR1和FGF2蛋白在休止期高表达,候选靶基因TGFBR2蛋白在生长期高表达;候选靶基因IGF1R蛋白在辽宁绒山羊皮肤毛囊生长期高表达,退行期低表达,候选靶基因FGF14蛋白在生长期高表达,休止期低表达;候选靶基因IGF1R和FGF14蛋白在乾华肉用美利奴羊皮肤毛囊生长期高表达,退行期低表达。7.双荧光素酶报告基因系统实验结果表明:对于辽宁绒山羊与乾华肉用美利奴羊,miR-1298-5p都能够抑制野生型TGFBR1和FGF2,miR-1-3p都能够抑制野生型IGF1R和FGF14,当靶位点突变后,只有被抑制的FGF2和FGF14荧光素酶活性得到恢复,说明miR-1298-5p可靶向调控FGF2,miR-1-3p可靶向调控FGF14。本研究利用高通量测序技术与荧光定量PCR技术明确了miR-1298-5p和miR-1-3p在辽宁绒山羊与乾华肉用美利奴羊皮肤毛囊组织的表达规律,利用荧光定量PCR技术和Western blot技术明确了候选靶基因TGFBR1、TGFBR2、FGF2、IGF1R与FGF14在辽宁绒山羊与乾华肉用美利奴羊皮肤毛囊组织内的核酸水平以及蛋白水平的表达规律,利用双荧光素酶报告基因系统实验确定了miR-1298-5p和miR-1-3p的靶基因分别为FGF2和FGF14,而miR-1298-5p和miR-1-3p可能正是通过与其靶基因靶位点的结合引起靶基因mRNA和蛋白的表达量改变,从而诱导毛囊周期性发生发育。


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