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越橘茎尖超低温保存及遗传稳定性鉴定研究

汪立宇  
【摘要】:越橘(Vaccinium)是重要的小浆果果树,果实中富含花色苷等多种生物活性物质,在国内外市场上引起广泛的重视和应用。栽培种和野生种在内的植物种质资源是传统育种和生物技术育种的先决条件,但由于环境污染严重、气候变暖等因素植物种质资源的生存受到严重威胁,因此,保存植物种质资源十分有必要。但传统的田间保存法和试管苗保存法都有各自的局限性,而超低温保存法不仅克服了前面两者的缺点,而且操作简便、不受病虫害侵染和自然灾害的威胁,可以长期有效的保存植物种质资源。本研究报道了以‘密斯梯’组培苗为试材,建立的小滴玻璃化法超低温保存越橘茎尖的体系。该超低温保存体系为:从4周苗龄组培苗取茎段(0.5cm),在Woody Plant Medium(WPM,Lloyd andMcCown,1980)培养基上培养,培养条件为4℃黑暗条件持续处理3周,剥取顶芽茎尖(长1.5-2.0mm)包含4-5片叶原基,将剥取的茎尖在含有0.3M蔗糖的预培养基上培养1天;预培养后的茎尖在含有1.0M蔗糖+2M甘油+WPM的加载液中处理30分钟(室温条件下);加载后的茎尖在植物玻璃化保护液‖(Plant vitrification solution 2,PVS2)中处理40分钟(冰上或0℃条件),然后在铝箔条(2cm x 0.8cm)上将茎尖转到制好的小滴(含3.5μl PVS2)中,迅速投入液氮中保存1小时;液氮冷冻后的茎尖迅速转入含有1.2M蔗糖+WPM的卸载液中解冻和卸载20分钟(室温条件下)。最后,将卸载后的茎尖接种到含有0.3mg L-1玉米素的WPM再生培养集中,暗处理1天后转入正常光照条件下培养。该体系获得了再生率最高为91.7%(‘密斯梯’),最低为46.7%(‘奥尼尔’),用于验证5个越橘基因型获得了平均再生率为66.5%。组织学观察发现超低温保存后茎尖的1-3片叶原基能够存活,4-5片叶原基被严重破坏。用ISSR(inter-simple sequence repeat)和RAPD(andrandom amplified polymorphic DNA)检测‘密斯梯’和‘奥尼尔’超低温后的再生植株,没有变异条带出现。


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