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蒙古白丽蘑的遗传多样性及其保育学研究

鲁铁  
【摘要】:蒙古白丽蘑Leucocalocybe mongolica(S.Imai)X.D.YuY.J.Yao原名蒙古口蘑Tricholoma mongolicum S.Imai,俗称白蘑、口蘑,是东北亚地区久负盛名的野生珍稀食药用菌,是蒙古高原的特有种。通常以蘑菇圈的形式生长在草原上。由于它的美味以及其强身健体、药食同源的属性,蒙古白丽蘑被当地居民和商人们掠夺性的采集、出售,导致它的生境持续受到影响,资源日渐减少。蒙古白丽蘑的生存遭遇前所未有的威胁以及处于濒临灭绝的状态。本文在野外调查的基础之上,从生理学、遗传学以及分子生态学角度探索如何保护濒危的珍稀菌物物种,充分合理利用野生资源的问题。关于蒙古白丽蘑的系统学地位,作为目前白丽蘑属的单种属的唯一成员,对其形态特征和基因信息的研究是属和种分类的关键。因为前期的研究仅涉及到LSU单一片段,而如今谱系一致的系统发育学种识别法(GCPSR)作为一个重要的研究手段影响着真菌的分子系统学。我们实施了一个基于最大似然法的多基因联合建树的分析方案,三个核糖体DNA区域(LSU,SSU,ITS)和线粒体区域(mtSSU)被选择用于对蒙古白丽蘑的分类学地位的界定。涉及到83份蕈菌样本,结果显示香蘑Lepista与蒙古白丽蘑在分子水平上存在较近的亲缘关系,而香蘑属Lepista和杯伞属Clitocybe都是多系类群。生理学特性方面,首先,孢子萌发机制的问题,选择5种培养基对蒙古白丽蘑孢子悬浮液的萌发状况进行了检测,其中改良的孟加拉红马铃薯培养基较利于孢子萌发。菌盖的直径与孢子萌发出菌落的数目呈现出正相关性。其次,核相的变化问题,采用荧光显微镜法观察了其核相交替现象。再次是生物学特性的研究,野外采集到的担子果经组织分离获取得到菌株,研究了其生物学特性,碳源、氮源、无机盐、生长因子单因素试验筛选每组最优的三个因子,综合菌丝日生长速率和生长势,碳源选择麦芽糖、淀粉和纤维二糖;氮源选择酵母浸膏,牛肉粉,牛肉浸膏;无机盐选择K_2HPO_4,Fe_2(SO_4)_3以及不添加;生长因子选择糙皮侧耳煮汁、胡萝卜煮汁、豆芽煮汁。对上述四个因素分别进行四因素三水平的正交试验,并确定了最佳菌丝生长条件。4个因素对正交体系的影响顺序是生长因子无机盐氮源碳源,方差齐性检验展示了四个因子的极显著差异性。菌丝营养生长最优条件为淀粉、牛肉膏、2%的胡萝卜煮汁、不添加无机盐。基于正交试验的优化所得的培养基基础之上研究其最佳温度和初始pH值,其结果为pH=6.5和25℃。蒙古白丽蘑在全球分布中仅在有限的范围内,由于特殊的栖息地,对其生理学研究具有必要性,实验显示无机盐和pH是影响菌丝生长的重要因素。蒙古白丽蘑的转录组和基因组方面,生物信息数据库查询不到相关数据,制约了对其深入的研究。基于简化基因组的测序分析表明RAD-seq不适用于蒙古白丽蘑SSR的开发。特定的DNA条形码像IGS1、ITS、RPB2和mtSSU在蒙古白丽蘑10个样本之间没有表现出理想的多态性。所以,实施了转录组从头测序,转录本获取的意义是为了促进基因的发现,了解活性物质生物合成的生理机制,识别微卫星位点以期作为探索蒙古白丽蘑遗传多样性的分子标记。依托Illumina公司的末端配对测序法获取42622958个clean data,拼接为37302个contigs,基于对已知蛋白质的相似性搜索,13821个unigenes得到了较好的BLAST结果,对这些unigenes使用7个公共数据库进行了注释,6642个unigenes被注释到基因本体数据库(GO)的三个功能性分组即分子功能、生物过程、细胞组成。使用直系同源簇比对的(COG)方法对一些未知基因进行预测,3914个unigenes被预测到25个COG分类项目中。4019个unigenes注释到了KEGG通路数据库,其中3110个在KEGG数据库中较好的匹配,被分类于5个主要分组,包括35个KEGG通路,同时又识别出了57个涉及萜类、甾醇类、不饱和脂肪酸类生物合成通路中的基因,次生代谢产物引起了越来越多的关注,转录组注释得到的活性物质代谢合成途径为建立了生化合成平台提供了基础性的研究数据。另外,对转录本进行了碳水化合物酶数据库的注释,结果显示总计446个碳水化合物酶相关的基因得以注释,和其他已公布的有代表性生态类型的蕈菌相比,碳水化合物酶结合模块(CBM)的数目相对其他蕈菌少,CE11、GT19、GT51、GT56、GH131、GH133、GH135在其他蕈菌中未被发现,这些特征性的碳水化合物酶基因可能在蒙古白丽蘑的营养基物的代谢过程中扮演一个重要的角色。基于组装得到的转录本数据,搜寻得到1860个微卫星位点,这些位点是蒙古白丽蘑候选分子标记。蒙古白丽蘑遗传多样性和种群结构的研究方面,我们通过2015年7月到2017年9月七次实地采样对蒙古白丽蘑主要分布地进行资源调查,采样范围主要围绕锡林郭勒草原、呼伦贝尔草原、贡格尔草原、张家口坝上草原四大草原区。基于转录本数据,90个EST-SSR引物使用eprimer3 v6.6.0程序进行开发,使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分型技术从中搜寻出8个多态性高的引物对。基于8个多态性的微卫星引物进行毛细管电泳分型,获取得到17个地理种群223个个体的402个等位基因。种群的等位基因数目从11到31个,平均每个种群24个,种群观测杂合度(Ho)从0.300到0.875,期盼杂合度(He)0.188到0.621。分子方差分析(AMOVA)表明,14.19%的遗传变异存在于种群之间(p0.001),而85.81%存在于种群内。17个地理种群平均的遗传分化系数F_(ST)为0.171,显示在种群间较低的遗传分化水平。曼特尔测试结果显示种群的遗传距离和地理距离缺乏显著相关性(r=0.049,p=0.28)。基于8个微卫星数据产生的UPGMA系统聚类图显示17个种群在0.8的Nei's相似性系数上分成了3个姐妹群。223个样本基于贝叶斯算法进行Structure分析,结果显示三个血统起源,将三个血统谱系在17个地理种群的分布情况映射到的地图坐标中进行可视化分析。17个种群的空间遗传结构使用AIS软件中的IGLS程序进行实现。综合分析表明,生境特征与种群遗传多样性及其种群结构有较大的相关性。另外,Barrier分析表明,整个分布区的南部区域(经纬度范围为43.2-45N,116.2E-118E)呈现出几个空间上分割的片状分布区。生境破碎化显现出连续生境被破坏成几个空间上遥远的斑块分布,保持和丰富种群的遗传多样性是蒙古白丽蘑就地保育的关键。本研究获得了种群结构和遗传多样性的数据,将为保育措施的制定提供依据。就地保护时,那些遗传多样性高的居群和区域应列为优先保护地区,以最大限度地保护其遗传多样性。关于蒙古白丽蘑的开发利用方面,目前担子果人工栽培技术缺乏实质性的突破,发酵技术作为资源利用的集约化途径极具前景。本文对液态发酵和固态发酵进行了研究。液态发酵最优的配方依次通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡坡度实验、响应面试验进行确定,其配方是蔗糖35.13 g/L、黄豆粉16.55 g/L、玉米浆粉33 g/L。在此基础上优化所得最佳培养条件为25℃、初始pH 6.5、120 rpm、装液量75 mL/250 mL、接种量12.5%。为了筛选固态发酵的最佳基质,对玉米粒、麦粒等5种基质进行了筛选,结果显示玉米粒是较优良的固态发酵基质,建立了玉米粒为主要基质成分的固态发酵工艺流程。使用担子果作为参照评估了两种发酵方式的产物的营养成分、挥发性组分。GC-MS结果显示21种挥发性成分可能是担子果的呈味物质。固态发酵前后的活性成分做了测定,检测显示黄酮类、多糖类、三萜类、甾醇类、酚类物质的含量都相对发酵前较大程度的提高。蒙古白丽蘑固态发酵技术值得更深入的研究推广。


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