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保加利亚乳杆菌诱变育种及玉米秸秆同步糖化发酵产D-乳酸工艺研究

肖雨  
【摘要】:秸秆是最丰富的木质纤维素资源之一,主要由纤维素、半纤维素和木质素组成,纤维素水解后可生成还原糖供发酵利用,如以秸秆为原料生物炼制乙醇、丁酸、乳酸及其他化工产品,是秸秆高值化利用的主要方向,得到了广泛关注。D-乳酸是乳酸的一种构象,被广泛应用于医药、工业、香料合成领域,随着乳酸行业的兴起,D-乳酸的需求量逐年上升。秸秆生物炼制D-乳酸过程中,存在产量低、副产物多、秸秆糖化率低等问题,为解决以上难题,本文首先以L-乳酸脱氢酶敲除菌WB01为出发菌株,应用等离子诱变技术结合紫外诱变技术,选育得到一株D-乳酸高产突变株。随后以氨基磺酸(NH_2SO_3H)为秸秆预处理试剂,与氯化钠(NaCl)协同作用预处理玉米秸秆,建立了一种绿色高效秸秆预处理工艺。最后,以预处理玉米秸秆为发酵培养基建立了玉米秸秆同步糖化产D-乳酸发酵工艺。1.实验菌种WB01最适菌体生长条件:温度37℃、转速120 rmp、pH值6.5;最优发酵产酸条件:接菌量5%、发酵温度42℃、葡萄糖初始浓度5%,在此条件下发酵D-乳酸产量36.9 g/L。2.常温等离子-紫外复合诱变条件为:等离子诱变时间60s、照射距离3mm,紫外照射时间60s、照射距离15 cm,放置于254nm的紫外诱变灯下。经过二轮等离子诱变筛选到2株正向突变菌,产酸量分别提高了27.1%和25.5%。等离子再次诱变后,获得了三株正向突变株分别较原始菌株提升了46.3%、44.2%、46.3%。在等离子诱变基础上,紫外多轮诱变后未能得到正向突变株,经过6代稳定性遗传检测,最终突变菌株W209能够保持稳定遗传。在温度42℃、接种量5%、初始糖浓度7%条件下,D-乳酸产量稳定在54 g/L。3.以玉米秸秆作为原料,以氨基磺酸(NH_2SO_3H)为磺化试剂,NaCl为复配试剂协同作用进行预处理,确定最佳预处理工艺,为4%NH_2SO_3H、3%NaCl共同作用,处理时间为60 min,处理温度为110℃,纤维素酶添加量30 FPU/g,酶解72 h,葡萄糖得率为80.94 mmol/L,葡萄糖转化率为71.92%。较单独用H_2SO_4、NH_2SO_3H、H_2O处理玉米秸秆葡萄糖转化率分别提高了36.76%、75.74%、242.43%。通过扫描电镜(SEM)、X-射线(XRD)、傅里叶红外光谱(FTIR)进一步表征预处理后玉米秸秆的结构变化,结果显示预处理后玉米秸秆表面变得疏松、孔洞增多,结晶度有所下降且发生重结晶现象,纤维素区的吸收峰增强,半纤维素区的吸收峰变弱。4.为提高菌株利用次数,本文研究了海藻酸钠固定化乳酸菌工艺流程,结果表明0.75%海藻酸钠,3%CaCl_2、电压为600 V、泵速为1.96 ml/min,震动频率为80 Hz时,颗粒均匀、表面平滑,微胶囊化包埋效果最佳,经固定化后的菌微胶囊保持了良好的保加利亚乳杆菌的活性,微囊化保加利亚乳杆菌经过2次连续发酵后的产酸量分别达到59.6 g/L、56.4 g/L。


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