水稻高效受体系统的建立及两种遗传转化方法的研究

【摘要】： 水稻是世界上重要的粮食作物，已成为分子生物学研究的模式作物之一。受体系统的建立和遗传转化已成为水稻分子生物学研究和基因工程的必须手段。由于水稻品种间遗传差异很大，且对植株再生和转化反应的基因型依赖性强，其再生和转化的复杂性和随机性很大。因此建立一种有效的、稳定的、再生系统和转化系统仍有许多问题需要细致深入的研究。本文在针对吉林省主栽的水稻品种进行了研究的过程中，优化了受体系统和遗传转化系统，并采用基因枪法和农杆菌介导法将Bt基因导入到优质的水稻品种中，获得了有价值的转基因植株。取得的主要研究结果如下： 一、优化了吉林省主栽水稻品种(系)成熟胚的再生系统。 1．成熟胚愈伤组织的诱导 (1)不同类型的六种培养基对五个水稻成熟胚愈伤组织的诱导效果差别很大。NMB、NB、CC得到了较好的致密愈伤组织诱导率，均超过了50％。 (2)不同种类的七种激素组合对愈伤组织的诱导效果不同，其中2，4-D浓度为1.0mg／L得到了77.5％的致密愈伤诱导率。 2．愈伤组织的继代培养 (1)六种继代培养基中，NMB对愈伤组织的继代效果最好，愈伤组织增重最快，并且愈伤组织为乳白色，结构致密的颗粒状。 (2)继代培养的过程中，加入4g／L甘露醇，愈伤组织增重快，且改善了愈伤组织质量。 3．在愈伤组织分化前进行预分化(10-30天)，不仅可以改善愈伤组织的生长状态而且大大提高了分化率，提高幅度达8倍多。 二、愈伤组织对Basta进行敏感性测定 根据愈伤组织在含有Basta继代培养基上的生长状况和褐化率，发现在转化后愈伤组织Basta的适宜选择浓度为8-10mg／L。 三、用GUS基因(β-glucuronidase)的瞬间表达研究，优化PDS-1000型基因枪的转化参数。 1．不同的轰击距离(6cm、9cm、12cm)转化效率不同。随着轰击距离的加大 吉林农业大学硕士学位论文 水稻高效受体系统的建立及两种遗传转化方法的研究 转化效率降低，分别为97.14%、85.”%、27.的%。当距离为6cm时，枪基后细 胞受损严重，揭化较多，因此9。m轰击距离较为适宜。 2.在轰击距离为9 cm的条件下，轰击1、2、3次，转化效率分别为85.29%， 91.89%和%.43%，所以轰击2次最佳。 四、根据农杆菌侵染后愈伤组织的生长状态和褐化率优化了农杆菌介导法的遗 传转化条件。 1.在农杆菌液浓度为ooeo。司.6464的条件下，侵染时间为20分钟较为适宜， 共培养3天后菌斑数为%.97%。 2.不同品种(基因型)的水稻愈伤组织对农杆菌的敏感性不同，其中农大3 号、丰优501对比A4404较为敏感，侵染后揭化率较高为76.47%和66.47%。 3.浸染后进行过渡培养，即先进行抑菌，不加入选择剂，7天后再进行选择， 可以降低褐化率500/0。 五、获得了转Bt基因的转基因水稻植株 应用农杆菌介导法将Bt基因导入到水稻品种丰优501中，共获得转化的植 株34株，其中n株经PCR检测呈阳性，并获得了可育的转基因植株3株，195 粒转化的后代种子。