大熊猫犬冠状病毒的分离鉴定及S基因部分序列的测定和分析

【摘要】： 本研究从某动物园两只死亡大熊猫的肝、脾等脏器分离病毒，经MDCK细胞适应培养，获得一株病毒(命名为DXMV)，在该细胞上可形成有规律的病变。电镜负染观察，病毒粒子有冠状纤突；超薄切片观察，于胞浆内形成病毒包涵体。理化学研究表明，该病毒为RNA病毒，对氯仿、乙醚敏感；胰酶试验中，经37℃、1小时处理的病毒，仍然能够在猫源细胞FCWF细胞上生长，并且毒力基本保持不变；耐酸性试验中，病毒分别在pH5.0和pH3.0经37℃作用2小时，毒力仅下降一个滴度；耐热性试验中，该病毒在恒定温度50℃，设定不同时间，从5分钟到150分钟，毒力均有不同程度下降，其中，50℃作用30分钟，病毒平均滴度下降2个单位；50℃，60分钟，CPE消失；恒定时间1小时，设定不同温度(50℃-60℃-70℃-80℃)，病毒在细胞上完全丧失增殖能力，CPE消失。生物学试验，利用实验室现有条件，选择不同的细胞系对该病毒进行培养，发现该病毒对猫源细胞FCWF最敏感；MDCK细胞次之；F81细胞经多次传代，亦可出现CPE；而Vero细胞则不敏感。血凝试验表明，该病毒对猪、鸡、人及豚鼠的红细胞均无血凝性。利用犬冠状病毒特异性血清经中和试验，初步可确定该分离病毒属于犬冠状病毒。 分子生物学研究方面，先选用多聚酶区冠状病毒通用引物2Bp和4Bm，该引物含有多个兼并碱基，能扩增出11种冠状病毒；合成该引物，选择大熊猫肝组织原代病料和该分离病毒的各代细胞培养物，均成功地扩增出了目的片段，而未接毒FCWF对照细胞PCR扩增阴性；在此基础上，又选择犬冠状病毒特异性引物，该引物是一种套式(Nested)引物，位于S基因201-1286bp之间，包括两对引物，CCVF1-CCVR1；CCVF2-CCVR2。第一对引物为外层引物，可扩增出1086bp的核酸片段；第二对引物为内层引物，可扩增出515bp的核酸片段。该引物以K378为参考株，含有多个兼并碱基，可扩增出包括K378、Insavc-1、CCV1-71、NVSL 吉林农业大学硕士学位论文 大熊猫犬冠状病毒的分离鉴定及s墓因部分序列的测定和分析 等多种犬冠状病毒。合成该套式引物，选择大熊猫原代病料和病毒各代细胞培养 物，经套式(N ested)RT一PcR扩增，可得到一与设计值5巧bP相符的DNA片段， 经BsT一xl(590，1110)酶切鉴定，证明该扩增片断为特异性片段;回收大熊猫肝 组织原代病料和细胞培养物第2、3、29代的ccvFZ一ccvRZ扩增片段，纯化，送 生物公司测序。序列用生物软件编辑，并比较各代次病毒基因序列，证明各代次 病毒为同一种病毒;回收丸熊猫第3代细胞培养物ccvFI一ccvRI lo86bP的PcR 扩增片段，纯化，测序，经生物软件编辑，得到一段1 o47bP的序列，然后与 Genbank上发表的各ccv毒株的核替酸序列进行分析比较，得到该分离病毒与 附sL、eevl一71、K37s、工n。avC一z的同源性分别达到了100%，99.5%，98.3%，88.5%; 推导的氛基酸序列同源性分别达到了100%，98.9%，%.6%，90.5%。 本研究首次从大熊猫体内分离和鉴定了ccv，揭示大熊猫亦可感染ccv，从而 为大熊猫的疾病防治工作提供了必要的信息和资料，同时也丰富了冠状病毒尤其 是犬冠状病毒的研究内容。