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细菌发酵法生产透明质酸的研究

于雷  
【摘要】: 透明质酸是由Myer和Palmer于1934年从牛眼的玻璃体中最先分离出此物质并加以命名的。它是生物体内普遍存在的酸性粘多糖类物质,化学本质为(1-β-4)D-葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙酰基-D-氨基葡糖组成的双糖单位重复连接构成的大分子糖胺聚糖。透明质酸主要分布于动物的结缔组织中,但不同来源的透明质酸化学结构完全相同,仅存在相对分子量的差异,而没有种属特异性。 由于特殊的生理作用,独特的流变学特性和极强的持水保湿能力,透明质酸在化妆品工业,医学研究,临床治疗等领域有着广泛的应用。 目前,透明质酸的生产方法逐渐由动物组织提取法转向微生物发酵法。细菌发酵法生产透明质酸具有产量不受原料资源限制,成本低,产量高,有较高的相对分子量,分离纯化工艺简便,易于大规模生产等特点成为透明质酸生产的发展方向,应当进一步深入研究。 本文作为吉林省科技厅“深层发酵法生产透明质酸”课题的部分内容,对细菌发酵法生产透明质酸进行了有益的探索,主要完成了以下工作,并得到了相关结论。 1、确定了有效的菌种筛选方法,从140份牛鼻粘膜中成功地筛选到了三株产透明质酸的菌株,为生产透明质酸奠定了基础。在初筛过程中,该菌株经血琼脂平板培养后的形态观察及荚膜染色镜检,证明为带有荚膜的乙型溶血性链球菌。在复筛过程中,利用红外吸收光谱法以目的代谢产物即透明质酸为目标,以Sigma公司生产的透明质酸为标样进行筛选。Sigma公司HA标准样品的红外谱图与发酵液精提物的红外谱图各自吸收峰的位置和形状基本相同,峰的相对强度相近。上述结果提示筛选菌株的产物呈较典型的HA红外吸收图谱。 2、确定了菌种诱变方法。紫外线诱变和亚硝基胍诱变,即物理诱变和化学试剂诱变相结合的复合处理,使血琼脂平板上的菌落形态明显变大,呈较大透明黏液状,并得到一株不具有溶血性的突变菌。 用紫外分光光谱法对发酵液精提物和标样透明质酸的水溶液进行分析,发酵液精提物的紫外光谱在196nm处有特征吸收,与sigma标样的相同。并且随着HA含量的增加吸光度值也变大,表明利用其最大波长处紫外光谱分析可以作为衡量发酵液中HA含量多少的依据。但发酵液中提取物在257nm和280nm处存在紫外吸收,这表明发酵液中提取物较sigma标样存在核酸和蛋白质等杂质。 将诱变处理前后的菌株发酵液精提物分别在波长196nm处进行紫外分光测 吉林农业大学硕士学位论文 细菌发酵法生产透明质酸的研究 量,其吸收分别为1.813和2.071。表明诱变后透明质酸的产量提高幅度不大。 3、确定了菌株种子培养基的最佳组成。基于菌体生长和透明质酸合成相偶 联,选择透明质酸的产量为试验指标,进行了碳源,氮源,碳氮比,有机氮和无 机氮协同作用对应指标的单因素试验。试验结果表明在其它控制条件不变的情况 下,以2%葡萄糖作为碳源,蛋白栋和酵母膏作为氮源,碳氮比为1:1,有机氮与 无机氮的比为5:1时,试验指标最高。 4、确定了摇瓶发酵培养基的最佳组成。同样选择透明质酸产量作为试验指 标,以葡萄糖,蛋白陈和酵母膏,NaNo3为试验因素设计正交试验玩必,通过对 获得数据进行分析和综合实际,摇瓶发酵培养基最佳组成确定为葡萄糖1%,蛋 白陈1%,酵母膏1%,NaNO3 0.5%。通过对种子培养基和发酵培养基优化得到 以蛋白陈和酵母膏复合氮源为主要成分的培养基,它们可以代替血清培养基,菌 体的生长良好。 5、确定了菌株的最佳培养条件。绘制出种子培养基中菌体的生长曲线,取 14一16h为接种的最佳种龄,发酵培养基中的最佳装液量确定为20nil/250d。培养 基和培养条件优化后,菌株发酵液精提物的紫外吸收由2.071提高至2.562,表明 透明质酸的产量有所提高。 6、确定了透明质酸的分离提纯工艺。通过乙醇沉淀和CPC络合等手段提取 出化妆品级透明质酸,其白色精提物HA中葡萄糖醛酸的含量为36.2%,比旋光 度为间ZOD二一680。但透明质酸产量较低,每100onu新鲜发酵液中得到浅黄色初 提物I诬A 2.779白色精提物H人0.9490


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