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电融合法构建海藻糖高产菌株的研究

彭帅  
【摘要】:本实验运用原生质体电融合技术,将高产海藻糖的菌株酿酒酵母As2.1416与具有STA基因能水解淀粉的糖化酵母As.1887进行融合,目的在于构建出既能利用淀粉又能高产海藻糖的菌株。并对影响原生质体形成率、再生率的各种因素以及影响电融合的各项参数进行了深入的探讨。以期能够找出这些因素的作用规律和最佳的作用参数,进而阐明融合的机理为利用原生质体融合技术进行微生物育种工作提供科学依据。研究结果如下: 1、原生质体形成率和再生率的影响因素 经过大量的对比实验确定: 1)最佳的酶浓度为0.3%;适宜的酶解时间为20min;最适酶促反应的温度为30~37℃;最适酶促反应的pH值为6~7。 2)对比了β-巯基乙醇不同用法影响原生质体形成率及再生率的关系,确定蜗牛酶及β-巯基乙醇混合液对菌体酶解的方法为最后方案。 3)不经同步培养的菌体酶解后原生质体的数量要比经同步培养的低,不利于融合的进行。因此,本实验采用将活化24小时的茵液放入冰箱中4℃保温2小时的同步培养方法。 4)对比了甘露醇(0.8mol/L)、山梨醇(1mol/L)和蔗糖(0.6mol/L)作为渗透压稳定剂的效果。结果表明,用甘露醇和蔗糖作渗透压稳定剂时原生质体形成率较高;用甘露醇和山梨醇作渗透压稳定剂时再生率较高。本实验确定以甘露醇作为渗透压稳定剂。 5)确定了碘乙酸用量0.6%,处理32分钟;热灭活的参数,60℃,45分钟。 2、融合参数的选择 1)实验结果表明两种茵具有不同的成串特性,As_21416理想细胞成串峰值出现在200v/cm左右,As1887的出现在250v/cm左右。因此本实验采用交变电场强度为250v/cm。 2)原生质体在电场中有不同的移动速度,需要调整原生质体的密度,使其在相同交变电场强度下有最高的理想成串率。本实验确定的最适密度10~5。 3)确定了原生质体在交变电场中的静止时间,在60s时原生质体能够形成高的理想细胞成串率。 吉林农业大学硕士学位论文 电融合法构建海藻搪高产菌株的研究 约通过电场强度的调整,理想细胞成串率分别由45%提高到55%,50%提高到59%。 得到的结论是电场强度的调整对提高理想细胞成串率有明显效果。 5)确定脉冲场强为5.skv/Cm,在此脉冲场强下,As2.1416和AS.1887的原生质体 存活率分别为71%、66%。 6)确定脉冲时间常数为30卜s,在此脉冲时间常数下,AsZ .1416和As .1887的原 生质体存活率分别为77%、70%。 7)确定脉冲个数为5个,在此脉冲个数下,AsZ .1416和A。.1887的原生质体存活 率分别为72令、69惫。 从所获得的融合子中,筛选出一株既能利用淀粉又能生产海藻糖的菌株。


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