收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

猪A组轮状病毒VP6基因的克隆与表达

丛彦龙  
【摘要】:猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,PRV)属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属,它作为腹泻的主要病原在世界范围内广泛流行,是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原之一。该病幼畜最为易感,1-4周龄仔猪发病率超过80%,死亡率7-20%,且症状严重,主要表现为严重腹泻,部分病例因严重脱水、酸碱平衡失调、继发感染而死亡[91]。鉴于其危害严重且无有效治疗手段,世界卫生组织将RV疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一,尤其是它的基因工程疫苗的研制更为重要。 动物机体存在着完整的粘膜免疫系统,该系统包括肠道相关的淋巴组织、呼吸道淋巴组织及乳腺、泌尿生殖道粘膜。肠道壁是机体的最大免疫器官,其粘膜产生的抗体远远大于体液。加之粘膜又是大多数病原的入口。因而,有人预测:未来的疫苗将主要发展成为经肠道免疫的疫苗。研究证实,小肠IgA为抗RV保护作用的相关因素,对于RV疫苗的研究者来说,最重要也是最富有挑战性的任务是构建一种能在肠粘膜表面诱导产生病毒特异性IgA的疫苗。RV组特异性抗原VP6蛋白,位于病毒的内壳,全长基因为1356bp,占病毒颗粒的51%,它在病毒的复制装配过程中起着重要作用,被认为是RV产生免疫的最重要蛋白,其虽不能刺激机体产生中和抗体,但可以刺激粘膜分泌sIgA,从而介导粘膜免疫,抵抗再次感染。该蛋白也具有一个能与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)产生交叉反应的抗原表位,同时VP6为RV组和亚组特异性抗原,无种属特异性,在疫苗中纳入该抗原可能有助于解决病毒变异问题。 RV主要保护性抗原基因已经被克隆和测序,但迄今为止报道的表达载体系统,多是以抗生素抗性作为外源基因稳定表达的压力。以抗生素为选择压力,虽然对克隆子容易进行筛选,但是由于抗药性基因不断向环境中漂移扩散,可能造成对环境微生态的破坏,带来严重后果,因而这类表达系统也离“食品级”还有很大的距离,不能直接用于人和动物。非抗性表达载体系统日益受到人们的关注。 由于重组保护性抗原受体菌株主要是活的减毒病原菌,而细菌疫苗的免疫保护力往往和菌株的残余毒力成正比。所以试图寻找能良好地表达外源性抗原且安全的受体菌株日益受到人们的关注。乳酸杆菌为人及动物体内正常菌群的重要成员,以乳酸杆菌作为表达外源保护性抗原基因的受体菌株,就可以将乳酸菌的生物学功能和外源功能抗原基因的特异性免疫相结合,同时乳酸杆菌作为正常生理性细菌,又符合新型疫苗的口服安全、方便、廉价等特点。 吉林农业大学硕士学位论文 猪A组轮状病毒VP6基因的克隆与表达 不难想象,如果将以非杭性载体表达系统基因为选择压力的“食品级”和“饲料级” 系统构建成功,就可以把RV的保护性抗原基因克隆入这种载体中,再导入乳酸菌受体 菌中,得到的这种重组工程乳酸杆菌将集益生菌和Rv基因产物的功能于一体,其科学 意义和应用前景将十分广阔。这类疫苗的研制成功将为Rv疫苗的发展探索一条新路。 本研究用恒河猴胚肾细胞(MA一104细胞系)增殖并扩增了PRv。根据Genebank已 发表的PRv vP6基因cDNA序列,利用Prime:5.0软件设计并合成了一对引物,通过反 转录聚合酶链式反应(RT一PCR)技术,从PRV的总RNA中扩增出长1 1 72bp的vP6基因 片段。通过T4 DNA连接酶将其直接连于克隆载体pGEM一T一easy中,构建了重组质粒 PGEM一T一P Rv6,再转化至受体菌JMI 09中。然后进行质粒提取并通过酶切、PCR鉴定、序 列测定,证明重组质粒中pT一P RV6中含有轮状病毒vP6基因。经氨基酸序列分析,表明 克隆了轮状病毒的主要保护性杭原vP6全基因的杭原表位区。 进一步将上述VP6基因克隆至PW425t的Sacl和KPnl之间的多克隆位点上,该载 体是以ThyA基因[”,96]为选择压力的非杭性的可在大肠杆菌和乳酸菌之间穿梭表达的 载体,将重组表达载体命名为pw425t一PRv6。经转化、鉴定,将阳性克隆pw425t一PRv6 在ThyA基因缺陷的大肠杆菌中进行表达。通过SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS一PAGE) 分析,表明vP6基因在大肠杆菌中得到了表达。we 5 t ern一blot检测,表明其具有免疫活 性。从而为下一步在乳酸菌中表达莫定基础。此技术平台为PRV的免疫防制提供新的手 段和可能,也为各种外源和内源的功能基因通过此载体在肠道共生乳酸菌中表达而更好 地发挥转基因工程乳酸菌的双重功能开创了一条崭新的道路。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 梁岳;方展强;;条纹密鲈卵黄蛋白原基因的克隆与检测[J];水产学报;2011年09期
2 ;[J];;年期
3 ;[J];;年期
4 ;[J];;年期
5 ;[J];;年期
6 ;[J];;年期
7 ;[J];;年期
8 ;[J];;年期
9 ;[J];;年期
10 ;[J];;年期
11 ;[J];;年期
12 ;[J];;年期
13 ;[J];;年期
14 ;[J];;年期
15 ;[J];;年期
16 ;[J];;年期
17 ;[J];;年期
18 ;[J];;年期
19 ;[J];;年期
20 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 曹威;栾颖;于波;;大鼠心肌细胞钙调磷酸酶Aβ基因的克隆与表达[A];第十三次全国心血管病学术会议论文集[C];2011年
2 宋鸿雁;严若峰;徐立新;宋小凯;李祥瑞;;堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶基因的克隆与表达[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
3 程军;董辉;郭涛;韩红玉;姜连连;赵其平;朱顺海;马卫娇;曾艳波;孔春林;李婷;黄兵;;柔嫩艾美耳球虫抗药性相关基因M_(20)的克隆与表达[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
4 韩焕兴;陆慧琦;安峰;叶伟民;范列英;朱桦;曾万杰;罗荣城;;人源生物工程抗-HBsFab的克隆与表达[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年
5 王春凤;刘兴友;丛彦龙;刘尚高;何昭阳;;A组轮状病毒VP6基因在乳酸菌表达载体中的克隆与序列分析[A];中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第七次学术研讨会论文集[C];2004年
6 梁新峰;陈书明;;麻鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆与表达[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年
7 黄涛;;猪COX7c基因的克隆与表达谱分析[A];第十二次全国畜禽遗传标记研讨会论文集[C];2010年
8 赵春梅;魏佳丽;王宁宁;付畅;崔继哲;;碱菀Na~+/H~+逆向转运蛋白基因的克隆与表达分析[A];植物分子生物学与现代农业——全国植物生物学研讨会论文摘要集[C];2010年
9 孟庆玲;乔军;陈创夫;任艳;张辉;;单核细胞增生性李氏杆菌内化素J基因的克隆与表达研究[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
10 马均;何业华;曹莉;许文天;郭翠红;夏靖娴;陈程杰;;菠萝SERK基因的克隆与表达分析[A];中国园艺学会2011年学术年会论文摘要集[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘怡辰;烷烃的微生物降解及其羟化酶基因的克隆与表达[D];南京农业大学;2010年
2 肖荣;短乳杆菌M8菌株的筛选及其slpM基因的克隆与表达研究[D];湖南农业大学;2012年
3 李惠华;龙眼体胚发生过程中激素代谢和信号转导相关基因的克隆与表达[D];福建农林大学;2010年
4 任磊;牡丹花器官发育相关基因的克隆与表达[D];中国林业科学研究院;2011年
5 张妙霞;野生香蕉(Musa spp., AB group)抗寒相关基因的克隆与表达分析[D];福建农林大学;2010年
6 吕凤霞;内生多粘芽孢杆菌纤溶酶的纯化、性质及其基因的克隆与表达[D];南京农业大学;2009年
7 戴汉川;几种不同鱼类肥胖基因的克隆与鲤肥胖基因的表达研究[D];华中农业大学;2005年
8 张云霞;巴西橡胶树HbMyb1调控基因的克隆及表达[D];华南热带农业大学;2005年
9 孙海峰;枣花分生组织特异基因的克隆与表达分析[D];山西大学;2009年
10 郑洁红;龙眼叶片黄酮类物质生物合成关键基因的克隆与表达研究[D];福建农林大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 丛彦龙;猪A组轮状病毒VP6基因的克隆与表达[D];吉林农业大学;2004年
2 孙柏;鸡Bcl10基因的克隆与表达[D];西北农林科技大学;2010年
3 李翔;茄子花青素生物合成关键基因的克隆与表达分析[D];上海交通大学;2011年
4 杨丽;嗜麦芽寡养单胞菌D2株碱性磷酸酶基因的克隆与表达[D];青岛大学;2010年
5 蔡欣;人白细胞介素22的克隆表达及功能研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
6 徐丽娟;中国大鲵Dmrt2基因的克隆与表达[D];湖南农业大学;2010年
7 闫朝选;甘蓝型油菜玉米黄素环氧酶基因(BnZEP)的克隆与表达分析[D];四川农业大学;2010年
8 罗雪;人sCR1结合功能域片段基因的克隆与表达[D];第三军医大学;2004年
9 吴娇娇;微生物脂肪酶基因的克隆与表达[D];华东理工大学;2011年
10 王友德;水稻纹枯病菌PG的分离纯化、理化性质及Rspg1基因的克隆与表达[D];扬州大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 记者 仇方迎;高校科技攻关一批成果快速投入防控[N];科技日报;2003年
2 本报记者 王建高 本报通讯员 刘世禄;青岛推进海洋酶工程产业化[N];科技日报;2001年
3 王志亮;监测疯牛病的哨兵[N];科技日报;2002年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978