猪圆环病毒2型吉林株的分离与鉴定及ORF2基因序列分析

【摘要】：本研究根据GenBank中已发表的猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)基因序列，设计一对PCV2特异性引物。利用PCR方法，对吉林省部分猪场的疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的9个自然病例的淋巴结、脾脏组织进行PCR检测。检测到阳性病料2份，检测阳性率为22.2％，说明该病在吉林省普遍存在。将检测阳性的病料组织研磨、离心、过滤除菌，接种到无PCV污染的PK-15细胞进行病毒分离。病毒在PK-15细胞上盲传4代后，提取病毒DNA，利用PCV2特异性引物对细胞培养物进行PCR检测，获得阳性结果，表明PCV2在无PCV污染的PK-15细胞中增殖培养成功。将PK-15细胞增殖所得的病毒样品处理，在电镜下可观察到直径约为17nm的圆形病毒样粒子。间接免疫荧光试验可观察到PCV2特异性免疫荧光。由此说明，分离出的病毒为猪圆环病毒2型，并命名为PCV2JL01和JL02株。 根据已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2的基因序列，设计一对PCV2的ORF2基因特异性引物，以病料组织和病毒的细胞DNA为模板，对PCV2的ORF2基因进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳，出现一条大小约0.7kb的特异性目的条带，与预期目的片段大小相符。利用DNA凝胶快速回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收，送大连宝生物公司测序。测序结果表明：PCV2 JL01和JL02株的ORF2基因序列均由702bp组成，通过比较发现，分离的JL01和JL02株ORF2基因同源性为99.9％，与其他PCV2毒株ORF2基因的同源性为91.9％～99.4％。 猪圆环病毒2型吉林株的分离鉴定、ORF2序列分析，为进一步开展猪圆环病毒病的病原学、诊断和防制研究奠定了基础，也为下一步开展的ORF2基因编码蛋白的生物活性及建立PCV2诊断试剂盒奠定基础。