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水貂犬瘟热病毒F基因的克隆及序列分析和表达

王卓聪  
【摘要】: 犬瘟热(Canine Distemper,CD)是由犬瘟热病毒(CDV)感染引起的一种急性、高度接触性传染性疾病,是当前我国对养犬业、毛皮动物养殖业危害最大的疫病之一。常规弱毒疫苗虽然在CD防控中发挥了非常重要的作用,但是也存在诸多缺点。为了研究新一代安全、高效的CD基因工程疫苗,本研究对本研究室分离的犬瘟热病毒分离株(CDVSJ)融合蛋白(F)基因进行了克隆、序列分析,构建了F基因的真核表达载体,并在BHK-21细胞中表达。本试验将为构建有效的预防CD的基因工程疫苗打下基础。 1、根据GenBank上发表的CDV Onderstepoort弱毒株F序列设计一对引物,对犬瘟热病毒水貂分离株CDVSJ株的F蛋白基因进行了RT-PCR扩增,并将其插入到pMD 18-T中,构建克隆载体pMD-18T-F。经序列测定,克隆的CDVSJ株F基因长1053bp,编码351个氨基酸。比较GenBank中收录的其它CDV毒株序列,发现CDVSJ株F基因与00-2601 USA株、01-2689 USA株、MS01 China株、ONP株、A75-17株、PDV-2株、DOGDK91C株核苷酸序列同源性分别为95.4%、94.4%、93.3%、97.3%、94.5%、94.7%、93.9%;CDVSJ株F基因与00-2601 USA株、01-2689 USA株、MS01 China株、ONP株、A75-17株、PDV-2株、DOGDK91C株氨基酸序列同源性分别为95.4%、94.4%、93.3%、97.3%、94.5%、94.7%、93.9%。但是在对CDVSJ与ONDER疫苗株、00-2601 USA株、MS01 China株、PDV-2株的抗原指数的分析中发现分离株CDVSJ与疫苗ONP株、00-2601 USA株、MS01 China株、PDV-2株在40-60位氨基酸间抗原指数存在较大差异;在110-120位氨基酸之间ONDER株和00-2601株抗原指数相同,其余三者在此区间抗原指数基本一致但是低于ONDER株和00-2601株抗原指数;在120-135位氨基酸之间只有PDV-2株的抗原指数与其余四者有相当大的差异性;在135-140位、190-200位和340-351位氨基酸分离株CDVSJ的抗原指数都与其余四者有着差异性。这表明有可能是由于不同分离株与疫苗ONP株之间预测的潜在的蛋白质抗原决定簇诸多差异性从而导致了免疫的失败。 2、对克隆载体pMD18T-F进行双酶切、回收纯化后,将得到的CDVSJ F基因定向克隆到pcDNA3.1真核表达载体中,经脂质体转染BHK-21细胞,通过间接荧光抗体检测法和RT-PCR法检测了重组表达质粒pcDNA3.1-F在BHK-21细胞中的瞬时表达情况。结果表明,提取pCDNA3.1-CDVF质粒转染的BHK-21细胞总RNA,进行RT-PCR反应,获得1053bp的特异性F基因条带;间接荧光抗体检测重组质粒pcDNA3.1-F转染的BHK-21细胞呈现特异性的黄绿色的荧光,而空载体pCDNA3.1(+)转染的BHK-21细胞与正常BHK-21细胞则无特异性黄绿色荧光,结果表明pCDNA3.1-F在BHK-21细胞中获得了表达。


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