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基于IRE1/JNK通路探讨解毒通络调肝方对2型糖尿病大鼠改善胰岛素抵抗及胰岛细胞凋亡的机制研究

金美英  
【摘要】:目的:通过动物实验及细胞实验观察解毒通络调肝方基于IRE1/JNK通路改善胰岛素抵抗及胰岛细胞保护的作用机制。方法:1、动物实验:通过Purina#5008饲养ZDF大鼠制备2型糖尿病动物模型,以随机血糖≥11.1mmol/L作为成模标准,将已成模ZDF大鼠分为模型组,盐酸二甲双胍组(0.5g·kg~(-1)·d~(-1)),解毒通络调肝方高剂量组(5g·kg~(-1)·d~(-1))、中剂量组(3g·kg~(-1)·d~(-1))、低剂量组(1g·kg~(-1)·d~(-1)),连续4周药物灌胃后处死大鼠,观察对大鼠体质量、糖脂代谢等影响,并利用免疫组织化学、RT-PCR法检测方法,观察胰岛组织中P-IRE1、IRE1、P-JNK、JNK蛋白以及IRS-1、PI3K、Bax、Bcl-2mRNA指标变化。2、细胞实验:体外培养大鼠胰岛β细胞瘤细胞株(INS-1细胞),采用MTT法检测解毒通络调肝方不同浓度对INS-1细胞增值的影响;以5ug/mL衣霉素刺激INS-1细胞6h制备内质网应激模型,以解毒通络调肝方(25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL)对其干预24h,提取细胞蛋白及mRNA,采用ELASA、Western blotting蛋白印迹技术,RT-PCR法检测方法,观察IRE1、JNK、IL-6、TNF-α、NF-κB表达,以及IRS-1、PI3K、Bax、Bcl-2mRNA指标变化。结果:动物实验1、观察ZDF大鼠2型糖尿病成模时间饲养诱导第11周符合2型糖尿病标准ZDF大鼠为73只,成模率82.95%。2、解毒通络调肝方对大鼠体重及糖、脂代谢的影响体重方面,与模型组比较,西药组、解毒通络调肝方高、中、低剂量组体重虽有下降趋势,但与正常组比无统计差异;观察GLU方面,与模型组比较西药组与解毒通络调肝方高、中剂量组有差异P0.05;在TC、TG方面,与模型组比较西药组、解毒通络调肝方高、中、低剂量组下降明显(P0.01,P0.05)。3、解毒通络调肝方对胰岛组织IRE1/JNK传导通路的影响免疫组织化学法检测,与模型组比较西药组、解毒通络调肝方高、中、低剂量组胰岛组织胞浆中IRE1、P-IREI、JNK、P-JNK蛋白表达明显减少(P0.05,P0.01)。4、解毒通络调肝方对胰岛组织的胰岛素抵抗及凋亡的影响运用RT-PCR检测,与模型组比较西药组、解毒通络调肝方低、中、高剂量组IRS-1、PI3KmRNA表达显著降低(P0.01)。与模型组比较西药组与解毒通络调肝方高、中剂量组均有明显降低Bax mRNA,升高Bcl-2 mRNA的表达(P0.01),并且均显著降低Bax/Bcl-2的比值(P0.01)。细胞实验1、解毒通络调肝方对INS-1细胞存活率与细胞凋亡的影响;采用MTT法检测,与对照组相比解毒通络调肝方12.5至100μg/mL不同剂量组,对INS-1细胞存活率无显着差异。当药物浓度达到150μg/mL时,与对照组比有细胞毒性。当衣霉素处理后INS-1细胞的细胞活力较对照组比较显著下降(P0.01),采用25、50和100μg/mL浓度解毒通路调肝方干预下,利用RT-PCR检测发现,与模型组相比INS-1细胞的BaxmRNA表达下降,Bcl-2mRNA表达增强,细胞存活率显著改善,且呈现计量依赖性(P0.05,P0.01)。2、解毒通络调肝方对衣霉素刺激INS-1细胞IRE1/JNK信号通路的影响利用Western blotting检测,解毒通络调肝方25、50和100μg/mL干预下,与模型组比IRE1和JNK2的表达显著降低(P0.05,P0.01);且当浓度为100μg/mL时,IRE1和JNK2的表达较模型组降低最为明显,呈现浓度依赖性。3、解毒通络调肝方对衣霉素刺激INS-1细胞NF-κB信号通路的影响利用Western blotting检测及ELASA检测,解毒通络调肝方25、50和100μg/mL干预下,与模型组比NF-κB,TNF-α和IL-6的表达显著降低(P0.05,P0.01);当浓度为100μg/mL时,NF-κB,TNF-α和IL-6的表达较模型组降低最为明显,呈现浓度依赖性。4、解毒通络调肝方对衣霉素刺激INS-1细胞胰岛素抵抗的影响RT-PCR法检测,解毒通络调肝方25、50和100μg/mL干预下,与模型组比较IRS-1和PI3K-1的mRNA表达增加(P0.05,P0.01),并呈剂量依赖性。结论:9周龄ZDF大鼠以Purina#5008饲养诱导11周时制备的T2DM动物模型,成模率最高,其模型高血糖状态持续性及稳定性最好。通过解毒通络调肝方干预ZDF大鼠2型糖尿病动物模型,可显著降低血糖、调节血脂。在机制方面,解毒通络调肝方可降低胰岛组织IRE1、P-IRE1及JNK、P-JNK的表达,抑制IREl/JNK信号通路,从而改善ERS,促进抗调亡蛋白和促调亡蛋白的相互平衡,进而达到胰岛细胞保护作用,并且通过介导IRS-1/PI3K胰岛素传导通路的激活,改善ZDF大鼠胰岛组织胰岛素抵抗。同时解毒通络调肝方对于衣霉素刺激的INS-1细胞,可能通过抑制IREl/JNK信号通路,干预NF-κB传导通路,减少炎症因子,从而减轻对ER的刺激,达到改善ERS,最终发挥对胰岛细胞保护以及改善IR作用。


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