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散结通脉方对动脉粥样硬化大鼠CD40/CD40L信号通路干预的实验研究

朱星  
【摘要】:目的:基于CD40/CD40L通路,借助动物实验及生物学研究手段,观察散结通脉方对动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)大鼠颈总动脉病理变化、血脂水平以及颈总动脉中CD40/CD40L通路相关信号分子的影响,初步揭示散结通脉方抗动脉粥样硬化机制,以期为“瘀能化水”理论提供可靠的实验证据。方法:实验一:60只雄性SD大鼠适应性喂养1周,随机挑选10只大鼠作为假手术组,该组大鼠只结扎颈外动脉不行球囊损伤,其余50只大鼠行颈总动脉球囊损伤术。术后1周,除假手术组继续喂食普通饲料外,其余各组大鼠均给于高脂饲料饲喂6周。根据前期预实验结果确定整个造模周期为7周。在造模7周末AS模型成功复制后,抽血检测各组大鼠血脂情况,并根据血脂结果将未分组大鼠随机分为AS模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、辛伐他汀组。分组完成后,各药物组大鼠分别给予相应药物干预:辛伐他汀组给予辛伐他汀(10mg/kg/d)灌胃,中药低、中、高剂量组分别给予散结通脉方生药浓度16g/kg/d、32g/kg/d、64g/kg/d灌胃,为保证实验的均衡性,假手术组、AS模型组均给予等容积的生理盐水灌胃(100g/1ml/d),持续4周。饲养12周末处死各组大鼠,采用HE染色法观察大鼠颈总动脉病理变化;采用分光光度计法检测大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量;采用ELASA法检测大鼠血清ox-LDL水平。实验二:大鼠前期造模及给药同实验一。处死大鼠后,采用ELISA法检测大鼠血清中TNF-α、sCD40L、IL-1β含量;采用Western blotting法检测大鼠颈总动脉中CD40、CD40L、NF-κBp65(核)、MCP-1、LOX-1蛋白表达水平;采用免疫组化法检测大鼠颈总动脉中ICAM-1、VCAM-1、MMP-9的蛋白表达;采用RT-PCR法检测大鼠颈总动脉中CD40、CD40L、NF-κBp65、MCP-1、LOX-1的基因表达。结果:实验一:1.颈总动脉HE染色结果显示:假手术组颈总动脉结构完整,内膜连续,平滑肌细胞及弹力纤维板排列整齐;AS模型组颈总动脉结构破坏明显,可见大量泡沫细胞、巨噬细胞及淋巴细胞浸润;散结通脉方低剂量组颈总动脉内膜不光滑,内皮下泡沫细胞及炎性细胞聚集较AS模型组明显减轻;辛伐他汀组、中药中剂量组、中药高剂量组颈总动脉病变显著减轻,未见明显的泡沫细胞及炎性细胞浸润。2.各组大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C检测结果显示:经药物干预后,各药物组TC、TG、LDL-C水平均较AS模型组极显著降低(P0.01),中药低剂量组HDL-C显著升高(P0.05),辛伐他汀组、中药高剂量组和中药中剂量组HDL-C水平升高更为明显(P0.01);与辛伐他汀组比较,中药高剂量组降低TC的功效较弱(P0.05),但在降低LDL-C方面效果明显(P0.05),并可极显著降低TG及升高HDL-C水平(P0.01),中药中剂量组降低TC的作用弱于辛伐他汀组(P0.05),但在降低TG方面优于辛伐他汀组(P0.05),在LDL-C、HDL-C的改善方面两组无明显差异(P0.05),中药低剂量组在改善TC方面弱于辛伐他汀组(P0.01),但TG、LDL-C、HDL-C结果与辛伐他汀组比较均无明显差异(P0.05)。3.各组大鼠血清中ox-LDL检测结果显示:经药物干预后与AS模型组比较,中药低剂量组ox-LDL显著降低(P0.05),而辛伐他汀组、中药高剂量组、中药低剂量组ox-LDL改善更加明显(P0.01),且中药高剂量组优于辛伐他汀组(P0.05)。实验二:1.大鼠血清中TNF-α、sCD40L、IL-1β含量检测结果显示:与假手术组相比,AS模型组血清TNF-α、sCD40L、IL-1β含量明显升高(P0.01);经药物干预后,AS大鼠血清中TNF-α、sCD40L、IL-1β含量极显著降低(P0.01),且在降低TNF-α、sCD40L、IL-1β方面,辛伐他汀组与中药中剂量组效力相当(P0.05),其功效显著强于中药低剂量组,但弱于中药高剂量组(P0.05)。2.大鼠颈总动脉中CD40/CD40L相关蛋白检测结果显示:与假手术组比较,AS模型组颈总动脉中CD40、CD40L、LOX-1、NF-κB p65(核)、MCP-1蛋白表达极显著升高(P0.01);与AS模型组比较,辛伐他汀组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组CD40、CD40L、LOX-1、NF-κB p65(核)的表达均极显著降低(P0.01),而在LOX-1、MCP-1方面,中药低剂量组有显著降低趋势(P0.05),但辛伐他汀组、中药中剂量组、中药高剂量组降低幅度更加明显(P0.01)。3.大鼠颈总动脉中CD40/CD40L相关基因检测结果显示:AS模型组CD40 mRNA、CD40L mRNA、LOX-1 mRNA、MCP-1 mRNA、NF-κBp65 mRNA的表达升高极为明显(P0.01),经相应药物干预后,辛伐他汀组颈总动脉中LOX-1 mRNA表达显著降低(P0.05),CD40mRNA、CD40L mRNA、MCP-1 mRNA、NF-κBp65 mRNA表达降低幅度更为显著(P0.01);中药低剂量组能显著抑制CD40L mRNA、LOX-1 mRNA的表达(P0.05),且对CD40 mRNA、MCP-1 mRNA、NF-κBp65 mRNA的表达抑制更加突出(P0.01);中药中剂量组LOX-1 mRNA的表达较AS模型组显著降低(P0.05),CD40 mRNA、CD40L mRNA、MCP-1 mRNA、NF-κBp65 mRNA表达降低幅度更为显著(P0.01);中药高剂量组颈总动脉中CD40 mRNA、CD40L mRNA、LOX-1 mRNA、MCP-1 mRNA、NF-κBp65 mRNA的表达均较AS模型组极显著降低(P0.01)。4.大鼠颈总动脉中ICAM-1、VCAM-1、MMP-9免疫组化结果显示:假手术组几乎无阳性染色,表明未见明显ICAM-1、VCAM-1、MMP-9蛋白表达;AS模型组可见大量的棕黄色颗粒,提示大量的ICAM-1、VCAM-1、MMP-9表达;辛伐他汀组、中药低剂量组、中药中剂量组,中药高剂量组棕黄色颗粒较AS模型组明显减少,提示经药物干预后颈总动脉中ICAM-1、VCAM-1、MMP-9表达下降。经半定量分析显示,AS模型组中ICAM-1阳性面积百分比较假手术组显著上升(P0.05),VCAM-1、MMP-9上升更为显著(P0.01);与AS模型组比较,辛伐他汀组ICAM-1阳性面积百分比显著下降(P0.05),VCAM-1、MMP-9下降幅度更大(P0.01),中药低剂量组ICAM-1、VCAM-1的表达明显减少(P0.05),而MMP-9的表达降低更加明显(P0.01),中药中剂量组、中药高剂量组ICAM-1、VCAM-1、MMP-9阳性面积百分比均较AS模型组极显著降低(P0.01)。结论:1.通过球囊损伤结合高脂饲料饲喂的方法可以建立大鼠AS病变模型,经散结通脉方干预能有效改善大鼠颈总动脉AS病变情况。2.散结通脉方能显著降低AS大鼠血清中TC、TG、LDL-C、ox-LDL含量,升高HDL-C水平,且中药低剂量组与辛伐他汀组效力相当,而中药中剂量组、中药高剂量组明显优于辛伐他汀组,具有良好的调脂功效。3.散结通脉方能够降低AS大鼠血清中TNF-α、sCD40L、IL-1β的表达,降低AS大鼠颈总动脉中CD40、CD40L、NF-κB p65、MCP-1、LOX-1蛋白及基因的表达,减少颈总动脉中VCAM-1、ICAM-1、MMP-9的表达,提示散结通脉方可能通过干预CD40/CD40L信号转导发挥抗AS作用。


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