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人参鹿茸中蛋白多肽的纯化及活性研究

严铭铭  
【摘要】: 本研究以人参(Panax ginseng C.A.Mey.)及鹿茸(Cervus nippon Temminck)为原料,采用中药化学及生物化学提取法,结合离子交换、凝胶过滤层析和反相C18层析等现代生物分离技术,对梅花鹿茸及人参中的蛋白及多肽进行了分离纯化。利用HPLC、MALDI-TOF-MS、ESI-MS及ESI-MS/MS等谱学技术,初步研究了这些蛋白多肽的结构,并从细胞水平进行了体外活性实验,探讨了蛋白与多肽的生物活性。 1从梅花鹿茸中分离纯化得到5个蛋白质及1个多肽,从人参中分离出1个多肽及3个蛋白。经Swiss-Prot和Genbank蛋白序列库检索,表明鹿茸蛋白CNTPⅢ及鹿茸多肽CNT14与已知蛋白序列的同源性远远小于50%,为新化合物。 2应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),测定了所分离的蛋白及多肽的分子量,采用Edman测序法对蛋白质CNTPⅢN末端进行了测序,序列中所含的丙氨基酸占15%,预示着此蛋白二级序列结构为α螺旋结构。并运用ESI-MS/MS技术测定了鹿茸多肽CNT14及人参多肽GS9的一级序列。采用反复冻融方法及MALDI-TOF-MS质谱证明蛋白CNTPⅡ和CNTPⅢ为蛋白CNTPⅠ的两个亚基。 3根据鹿茸多肽CNT14的一级序列,采用固相FMOC合成方法,以不溶性树脂作为载体,从C端——N端对多肽进行了合成,并运用HPLC高效液相色谱、ESI-MS质谱技术及ESI-MS/MS质谱测序技术,证实合成多肽与从鹿茸中分离出的多肽CNT14结构一致。 4鹿茸活性实验研究表明,蛋白CNTPⅣ对骨肉瘤细胞U20S细胞生长有抑制作用;蛋白CNTPⅢ及多肽CNT14对小鼠海马细胞具有极显著的增殖作用,预示着二者在抗衰老药物方面具有一定的前景,同时,鹿茸多肽CNT14对表皮细胞、肋软骨细胞、脾细胞均具有增殖作用,推断CNT14可能是一种细胞生长因子。 5人参蛋白及多肽药理活性实验表明,人参蛋白GSPⅡ对金黄色葡萄球菌具有抑制作用;人参多肽GS9具有抑制肿瘤细胞与活化血小板间黏附的作用,在抗肿瘤转移方面具有一定的活性。 6以人参蛋白GSPⅡ的抑菌活性为基础,探讨了温度及pH值变化对人参蛋白GSPⅡ抑菌活性的影响,为优化人参加工工艺提供了理论参数。


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