外源基因GFP在白三叶草生物反应器系统中转录的研究

【摘要】：目前,以植物作为生物反应器是一种生产高价值蛋白质的有效途径,并且已有大量证据表明植物生物反应器具有大规模生产高质量蛋白质的潜力。因此,对植物生物反应器的技术与策略进行深入研究是非常必要的。只有更详细地研究植物细胞内的 RNA 转录过程、转录子的稳定性、RNA 结构以及蛋白质翻译的效率等因素,才能够在植物细胞内获得高水平表达的外源蛋白质。因此,我们尝试建立一个模式系统,用以研究和分析植物细胞中导致外源基因表达差异的影响因素,进而找到提高外源蛋白质表达水平的策略,获得高效、稳定地生产高价值蛋白质的植物生物反应器系统。 在我们的研究中,能够定量地分析比较植物细胞中转录产物水平的差异非常重要。因此,我们以此为突破点,试图从多方面寻找提高 cDNA 合成的质量、数量和稳定性的方法。众所周知,cDNA 合成过程对于定量研究转录水平存在重要影响,而且其数量和质量也直接影响定量的精确性。所以,我们以α-Tubulin 作为研究对象,利用半定量 PCR和实时 PCR 相结合来评价不同引物以及其工作浓度和 DTT 的存在对于 cDNA 合成的影响。 试验结果表明,与传统引物 B26 相比较,由 5 种 anchored oligo dT 构成的组合引物能够显著提高α-Tubulin cDNA 的数量和质量,并且较高的引物工作浓度(500 ng/ eacholigo per reaction)对 cDNA 合成的正效应更加明显。同时,在 cDNA 合成过程中不添加DTT 也明显地提高了 cDNA 合成的水平。本研究首次在植物系统中利用两种实验技术对影响 cDNA 合成的多种因素进行了半定量和定量的对比分析,试验结果对于提高 cDNA 的合成提出了简便可靠的方法。此外,这一研究的结果对于 Microarry 等转录分析研究也具有重要意义。 为了建立模式系统,我们构建了两个表达载体,Double35S-GFP 和-90-GFP。在GFP 编码区前面引入了一段具有很强功能的翻译启始保守序列,其中-3 位的 A 和 +4位的 G 符合 Kozak consensus,-10 A 则是能够特异性地提高白三叶细胞内蛋白质基因翻译效率的保守位点。同时两个新的酶切位点 ClaI, XhoI 也被引入到 GFP 的 5‘UTR末端,以后将在此处插入新的功能序列以便研究 UTR 的二级结构对 GFP 表达的影响。将这 两 个 表 达 载 体 导 入 农 杆 菌 , 获 得 的 农 杆 菌 菌 株 AGL1pSoup-pG0020 和AGL1pSoup-pG0023 用来转化白三叶草叶片。 优化试验显示,在实时 PCR 中,用来制作标准曲线的外参质粒 Tubulin#2 的工作浓度不能低于 10 ag/ul;使用引物 BADF159 和 BADR160 扩增 GFP 的效果较好,其最佳工作浓度均为 300 nM;用于真空侵染的的工程菌的浓度越高,外源 GFP 在植物细胞中的表达水平就越高,因此 OD600值为 2.205 作为农杆菌真空侵染的最佳工作浓度。 利用携带有 35S-GFP 载体和-90-GFP 载体的农杆菌对处于不同发育阶段的白三叶的叶片进行真空侵染。然后,我们对瞬时转录产物进行定量分析。实时 PCR 的分析结果表明不仅两个不同基因型的白三叶草叶片细胞中外源 GFP 的转录水平存在差异,而且即 使是在同一个基因型中,不同的叶片之间转录水平也存在差异。(1)Geno 4 和 Geno 10两个基因型的白三叶草叶片中 GFP 的表达水平具有相似的趋势:与幼嫩叶片和衰老叶片相比,成熟的叶片可以转录产生更多的 GFP。例如,基因型 Geno 4 的第 9 和 11 片叶子分别产生 1335.6 和 1401.87 atto mol 的 GFP。幼嫩叶片,如第 3 和第 5 叶片分别产生524.08 和 673.17 atto mol 的 GFP,明显少于成熟叶片。在 Geno 10 中,第 9 叶片可以产生 1075.33 atto mol GFP,高于其它叶片的表达水平。而老叶片,例如 13 叶片,外源基因表达水平明显低于其它叶片。(2)在两个基因型叶片中,尽管-90-GFP 载体产生的 GFP 的表达量略高于 35S-GFP 载体,但是两者之间不存在明显差异;产生这种现象的原因可能是 35S 启动子能够诱导植物细胞中基因沉默机制的发生。(3)从总体角度分析,Geno 4 和 Geno 10 中表达的 GFP 的平均数量分别是 944.17 和 718.84 atto mol,差异不显著。(4)同一基因型中,不同发育阶段的叶片中表达外源 GFP 的水平受到该叶片中叶绿素含量的影响。值得注意的是无论是 Geno 4 还是 Geno10 中,成熟叶片第 9 叶片中含有较高的叶绿素,而且外源 GFP 表达水平也较高。此外,衰老叶片(例如 Geno 10的第 11,13 片叶)中叶绿素含量要明显低于第 9 叶片,相应的外源 GFP 的表达量也较低。因此,我们得出结论认为外源蛋白的表达量与转化前植物叶片中叶绿素含量具有一定的相关性;可能是由于降解的叶绿素为转化叶片的细胞中正在转录的外源 GFP 和内源Tubulin 提供充足的 N 源和 C 源。 我们还从白三叶草植物基因组 DNA 中克隆获得了 Tubulin 基因家族的 3 个新的 DNA片段。它们是 793 bps 的 Tubulin 2 (GenBank accession number: AY569008), 755 bps的 Tubulin 4 (GenBank accession number: AY570543) 和 717 bps 的 Tubulin 7(GenBank accession number:AY570544)。