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低温诱导表达载体的构建与冷激蛋白cspA基因启动子区调控表达的机制研究

马波  
【摘要】:当温度突然降低时,原核生物和真核生物都会表现出冷激反应,它们会通过合成冷激蛋白(cold shock proteins,CSPs)来克服冷激的不利影响。CspA 是大肠杆菌中一种主要的冷激蛋白,近来研究人员对其结构、功能和在转录、翻译水平的调控以及 mRNA稳定性等方面作了大量研究。但对于 CspA 基因上游调控元件存在的真实性、5’-UTR 3’端的作用,以及两个 ATGAAA 序列基元的作用机制仍然存在很大的争议。 本实验旨在构建包含 CspA 冷激启动子的低温表达载体,探讨 cspA 启动子及其上下游区域的表达调控机制,并通过报告基因 cecropinB 测定其转录表达活性,同时期望获得 CecropinB 的高效融合表达载体。本论文所使用的 CecropinB 是黑腹果蝇的一种抗菌肽的前体,含有 63 个氨基酸序列,其中 1-23 aa 为信号肽序列。抗菌肽能抵抗果蝇正常生活环境中的各种病原微生物的感染,是自然免疫系统的一部分,可以导致大肠杆菌的死亡。 以 E. coli 基因组 DNA 为模板扩增了 9 段具有 CspA 冷激启动子及其他不同调节元件的片段,用其替换掉 pET28a(+)载体上的 T7 启动子。提取果蝇的总 RNA,通过体外反转录获得 cDNA,以其为模板,PCR 扩增出 cecropinB 的全长 cDNA 序列,构建了四个含有冷激启动子以CecropinB为报告基因的表达载体pMBC系列(pMBC2、pMBC3、pMBC4 和 pMBC5),以及含有 T7 启动子的 cecropinB 的表达质粒 pCEC。 pMBC 系列载体、pCEC 质粒诱导表达,通过宿主菌大肠杆菌 BL21 生长曲线的测试,报告基因 cecropinB 融合蛋白的 SDS-PAGE 分析以及 cecropinB mRNA 的 RT-PCR 结果分析,表明 pMBC2 在低温下的表达效率与 pCEC 在 37℃ IPTG 诱导表达效率相同,pMBC3、pMBC4、pMBC5 的低温诱导表达效率略低于 pMBC2,pCEC 在低温条件下的诱导表达效率极低。 另外,缺失实验分析显示 cspA mRNA 的 5’-UTR 的 3’端对于外源蛋白的表达没有明显的作用,截短的 5’-UTR 与野生型的同样获得了较高的表达效率。cspA 启动子上游调控元件的缺失也同样不影响外源蛋白的表达。


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