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中国松嫩平原三种重要耐盐碱牧草的组织培养和体细胞克隆变异研究

李晓玲  
【摘要】: 本研究分别以短芒野大麦幼穗、星星草成熟种子和朝鲜碱茅成熟种子为外植体,建立了稳定、高效的三种重要耐盐碱牧草组织培养体系。并应用AFLP、S-SAP和MSAP三种分子标记技术对短芒野大麦、星星草和朝鲜碱茅在组织培养过程中产生的遗传变异和基于DNA甲基化变异的表观遗传变异进行了比较分析。研究结果表明,短芒野大麦、星星草和朝鲜碱茅三种牧草的愈伤组织和再生植株在分子水平上均发生了遗传变异和表观遗传变异,且二者在有些情况下密切相关。 选用18对AFLP选择性扩增引物对短芒野大麦供体亲本植株、两瓶愈伤组织和随机选取的44株再生苗进行选择性扩增,共产生793条清晰扩增带,其中73条呈多态性,多态比例为9.3%。不同再生植株产生的多态性条带数目变化很大,从2到55条不等。其中大多数再生植株(68.2%)积累了2-3个变异,而少数再生植株则产生了大量的多态性位点。选用24对S-SAP选择性扩增引物对已进行AFLP检测的两瓶愈伤组织和有代表性的8株再生植株样本进行选择性扩增,共产生768条清晰带,其中151条呈多态性,多态性比例为19.7%,但没有发现BARE-1转座的直接证据。选用22对MSAP选择性扩增引物对以上同样愈伤组织和再生植株进行了选择性扩增,检测到170-196个甲基化的CCGG位点。结果表明,在短芒野大麦再生植株中,CCGG位点内侧C完全甲基化水平和外侧C半甲基化水平及总的甲基化水平均较亲本显著降低,甲基化变异的主要模式是内侧C去甲基化变异。序列分析结果显示,短芒野大麦发生遗传变异和甲基化变异的基因组位点均包括已知功能基因和转座元件。Mentel检测结果表明,MSAP检测结果和S-SAP检测结果之间在统计学上具有显著相关性,其相关系数为0.8118(1000排列, p0.01),而MSAP检测结果和AFLP检测结果之间没有明显相关性(r=0.1048)。 对来源于同一粒星星草种子的实生苗、3瓶愈伤组织及8株再生植株,分别进行了AFLP、S-SAP和MSAP分析。选用19对AFLP选择性扩增引物对其进行扩增,共产生925条清晰扩增带,其中16条呈多态性,多态性位点比例为1.7%。选用24对S-SAP引物对上述样本进行选择性扩增,共扩增出789个位点,其中36个位点具有多态性,多态性位点比例为4.6%。用16对MSAP选择性扩增引物对其进行扩增,分别检测到163-170个甲基化的CCGG位点。与亲本植株相比较,供试的3瓶愈伤组织在所检测到的CCGG位点上两种甲基化即外侧C半甲基化和内侧C完全甲基化水平均表现为轻微程度的降低,变化的主要模式是内侧C去甲基化变异高于超甲基化变异,而再生植株DNA甲基化水平与亲本植株对应的甲基化水平之间差异不显著。Mentel检测结果表明MSAP检测到的DNA甲基化变异及AFLP和S-SAP检测到的遗传变异之间均没有显著的相关性。 同样,对来源于同一粒朝鲜碱茅种子的实生苗、3瓶愈伤组织及8株再生苗,分别进行了AFLP、S-SAP和MSAP分析。选用19对AFLP引物对其进行选择性扩增,共产生952条清晰扩增带,其中59条呈多态性,多态比例为6.2%。用24对S-SAP选择性扩增引物对上述


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