流行性乙型脑炎病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

【摘要】： 流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE)是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的严重的人畜共患病,对人类健康和畜牧业生产危害巨大。目前,乙型脑炎病毒的检测方法有病毒分离鉴定、免疫学检测、分子生物学检测等。这些检测方法虽然为乙型脑炎的诊断提供了强大的技术支持,但存在着耗时长,费用高等缺点。环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种新型的分子生物学检测技术,若能利用该技术检测流行性乙型脑炎病毒可以克服以上缺点。 本研究根据JEV基因序列设计了3对特异性引物,采用LAMP方法对流行性乙型脑炎病毒核酸进行等温扩增,建立优化了两步法和一步法两种检测方法。两步法LAMP检测体系中含有0.2μMF3、B3,2μM FIP、BIP,0.8μM FLP、BLP, 0.4mM dNTP,20 mM Tris-HCI (pH8.8),10 mM KCl,10 mM (NH4)2SO4,6 mM Mg2+,0.1%Triton X-100,1.1 mM Betaine,8U BST聚合酶,于65℃水浴锅中放置60min。一步法RT-LAMP检测体系中0.2μM F3、B3,2μM FIP、BIP,0.8μM FLP、BLP,0.8mM dNTPs,20mM Tris-HCl(pH8.8), 10mMKCl,10 mM (NH4)2SO4, 6mMMg2+,0.1%Triton X-100,1.1 mM Betaine,8 U BST聚合酶,1 U AMV反转录酶,于65℃水浴锅中放置70min即可完成反应。两种检测方法均可在扩增产物中加入SYBR Green I染料,直接或在紫外光下观察颜色变化判定结果。试验表明LAMP方法比RT-PCR灵敏度高10倍,并具有较高的特异性,对猪细小病毒、猪小环状病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒等类似病毒均无交叉反应。且LAMP试剂在-20℃下具有良好的稳定性。