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胶体金标记四环素类抗生素单克隆抗体探针的研究

徐桂连  
【摘要】: 四环素类抗生素广泛应用于畜牧、水产养殖业中,其大量频繁和不当的使用引起了严重的药物残留问题。四环素类抗生素在动物源性食品中的残留,通过食物链危害人体健康,引起严重的过敏性反应,致畸、致癌、致突变作用。因而建立快速、灵敏、准确的四环素类抗生素残留检测的方法刻不容缓。目前,应用于四环素类抗生素残留的检测方法主要有仪器分析法、免疫方法、化学发光分析方法等。如高效液相色谱,高效液相色谱串联质谱,酶联免疫检测方法。这些方法具有精确度高、灵敏等优点。但其存在操作繁琐、样品处理复杂、成本高、不适合现场检测等缺点。因而,迫切需要一种简单、快速、灵敏、准确、适时实地的检测四环素类抗生素残留的方法。 胶体金免疫层析技术(GICA)具有快捷迅速、灵敏准确;安全简便,不需任何仪器和设备;外界因素影响较小,适合进行现场检测;成本低廉,所需试剂和样本量少。然而要建立胶体金免疫层析技术,必须首先制备胶体金标记抗体探针。 因此,本研究的目的是建立稳定分泌四环素类抗生素抗体的杂交瘤细胞株、制备四环素类抗生素单克隆抗体,制备生物活性胶体金标记四环素类抗生素抗体探针、以用于四环素残留检测的胶体金免疫层析技术中。 首先采用邻联甲苯胺法和碳化二亚胺法将4种四环素类抗生素(四环素、土霉素、金霉素、强力霉素)与牛血清白蛋白和卵清白蛋白偶联分别制得人工免疫抗原及包被抗原。通过紫外波长扫描与偶联率分析,将最佳人工免疫原进一步采用红外光谱鉴定偶联情况,结果表明偶联成功。 用最佳人工免疫抗原免疫BALB/c雌性小鼠,当间接ELISA测定小鼠抗血清效价达到1:6400以上时,取高效价血清小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用建立的间接ELISA法筛选阳性孔。克隆阳性杂交瘤细胞株获得土霉素、金霉素单克隆的细胞株,鉴定单克隆抗体亚型。 培养土霉素、金霉素单克隆阳性细胞株,腹水诱生制备土霉素、金霉素单克隆抗体。收集腹水,经辛酸-硫酸铵法纯化、透析除盐获得土霉素、金霉素单克隆抗体。土霉素、金霉素单克隆抗体经胶体金标记,获得生物活性的金标抗体。


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