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藻胆蛋白的双水相绿色提取技术研究

丙潇潇  
【摘要】: 藻胆蛋白是存在于红藻、蓝藻中的一种水溶性色素蛋白,其捕光天线结构能够使藻类的光合作用得以发生,可用于环境功能材料的研究。因此,藻胆蛋白的提取成为目前的研究方向,本课题旨在寻求一种高效快速、清洁环保的藻胆蛋白分离纯化技术。双水相体系具有分离条件温和,质量传输快,成本低,易操作,可调节等特点,与传统的有机溶剂萃取体系相比较,双水相萃取体系在生物物质的分离中有独到的优越之处。采用双水相萃取技术对藻胆蛋白进行分离纯化,可实现藻胆蛋白的绿色高效提取,满足本课题的目的和要求,具有重要的环境意义。 本论文以坛紫菜藻中的R-藻红蛋白(R-PE)和钝顶螺旋藻中的C-藻蓝蛋白(C-PC)为研究对象,探讨藻胆蛋白的细胞破碎提取方法和双水相体系分离纯化方法。 分别采用反复冻融法、液氮研磨法、细胞溶胀法、低浓度CaCl_2提取法、SDS溶液提取法、纤维素酶提取法、超声波破碎法提取藻胆蛋白。研究结果表明,对于R-PE,反复冻融法的效果最佳:在-20℃和4℃之间,以0.01M磷酸盐缓冲液为溶剂,冷冻时间为2 h,反复冻融6次,得到较高纯度0.63。对于C-PC,细胞溶胀法提取法效果最佳,采用蒸馏水4℃下提取120 h,C-PC纯度可以达到0.57。 分析两种藻类提取液的光谱特性,R-PE特征吸收峰位于560nm,室温荧光发射峰位于579nm;C-PC特征吸收峰位于620nm,室温荧光发射峰位于665nm;说明实验得到的提取液中含有目标蛋白,且具有一定的荧光性和生物活性。采用PEG/硫酸铵双水相体系对藻胆蛋白进行分离,并与传统盐析法的分离效果相比较。研究结果表明,传统盐析法在硫酸铵饱和度为45~55%时,分离R-PE得到纯度大于1.36,得率大于70%;在硫酸铵饱和度为40~45%时,分离C-PC得到纯度大于0.80,得率大于40%;由于高盐环境导致部分目标蛋白变性而藻胆蛋白的得率较低。PEG/硫酸铵双水相萃取法在W_(PEG1000)= 10%,W_((NH4)2SO4)=15%时,得到最佳分离效果,R-PE纯度达到0.91,回收率98.5%;在W_(PEG4000)= 10%,W_((NH4)2SO4)=12.6%,得到最佳分离效果,C-PC纯度达到1.00,回收率97.2%。;PEG/硫酸铵双水相萃取法具有实验操作简便省时,回收率高,且PEG对藻胆蛋白具有稳定作用等特点,因此PEG/硫酸铵双水相萃取法较传统盐析法具有一定优势。 采用不同PEG/磷酸盐双水相体系对藻胆蛋白进行分离,以正交试验分析的方法考察PEG分子量、PEG质量分数、磷酸盐质量分数以及体系pH值对分离效果的影响,确定各因素的最优水平及影响因素的主次顺序,并比较NaHP和KHP对双水相体系分配的影响。研究结果表明,R-PE和C-PC在PEG2000/KHP双水相体系中分离效果较好,在W_(PEG)=14%,W_(KHP)=18%,pH6.8时,R-PE分离效果最佳,纯度达到1.07,回收率98.6%;在W_(PEG)=12%,W_(KHP)=20%,pH5.6时,C-PC分离效果最佳,纯度达到1.16,回收率98.2%。 R-PE和C-PC在经过双水相体系分离后,均可获得较高的回收率,说明双水相体系分离过程温和,藻胆蛋白的损失较小,有利于进行产业规模化生产;双水相萃取得到的C-PC纯度高于R-PE的纯度,说明本课题采用的双水相体系更适于从细胞结构简单的原核细胞中分离C-PC,对于存在于真核细胞中的R-PE,有待改进双水相体系来进一步提高分离效果。


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