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肝细胞癌N-糖链的结构改变及其机制研究

刘侠  
【摘要】:肝细胞癌(HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,其病情进展快、预后差,因早期诊断困难、治疗手段有限而死亡率高。因此,研究其发生发展的分子基础,寻找HCC早期诊断生物标志物和潜在治疗靶点,对HCC的诊断和治疗具有重要意义。 糖蛋白糖链参与细胞识别、信号传导、免疫监视,维持着多细胞生物体各项有序性生命活动。糖链的异常改变通常与多种疾病包括肿瘤的发生发展密切相关。对恶性肿瘤特异性糖链结构与功能的研究不仅可以揭示糖链的生物学功能,还能为肿瘤生物标志物的筛选和新药靶点的开发奠定基础。DSA-FACE技术是本世纪初新兴的糖生物学检测技术,因其高通量、高灵敏度的特点,目前已在肿瘤血清生物标志物研究中得到足够认识,但利用该技术对非血清样本的研究则少有报道。 本文从糖生物学角度、利用DSA-FACE技术对HCC特异性N-糖链结构及其发生异常改变的分子机理进行研究,以期为HCC的早期诊断、恶性演进和转移预测提供生物标志物,为HCC靶向治疗靶点选择及基于糖链结构改变的恶性转化机制研究奠定基础。在研究中,首先优化了血清糖蛋白N-糖组DSA-FACE检测技术,有效提高了其检测效率。在此基础上,建立了可用于体外培养细胞系及临床组织样本细胞表面N-糖组分析技术,通过分析膜蛋白不同制备方法(去污剂法和超速离心法),并引入石墨化炭黑(GC)树脂纯化技术、优化研究体系,使得该技术对于细胞表面N-糖组的检测更加灵敏、可靠,并具有良好的可重复性,从而拓展了DSA-FACE技术的应用范围,突破了以往只用于检测血清样本N-糖组的局限性。 在优化N-糖链检测技术的基础上,本文分析了北方地区190例HCC患者血清样本,以110例乙肝病毒感染者及179例健康人血清样本作为对照。结果发现,由血清中三个发生异常变化的N-糖链NGA2F、NGA2FB和NA3联合获得的Log[(NGA2F+NGA2FB)/NA3]指标对于HCC的诊断准确性可达85%,诊断灵敏度和特异性分别可达到71.1%和86.0%,且该指标的诊断准确性不受患者性别、年龄、肿瘤病理分期、癌细胞分化程度等因素影响。深入分析本研究中40例AFP处于正常值范围(AFP 20ng/mL)的HCC患者血清,结果显示有23例血清中Log[(NGA2F+NGA2FB)/NA3]指标明显高于阈值(0.1045),证明该指标可有效降低AFP对于HCC的漏诊率。进一步利用Logistic回归分析法建立基于血清特异性糖链(NGA2F、NGA2FB、NA3)与AFP的联合诊断模型,ROC曲线分析表明,联合诊断模型对于HCC的诊断准确性可达到94.8%。该结果证实,以血清N-糖链生物标志物为基础的联合诊断模型可作为我国北方地区HCC特异性的普查生物标志物。 利用本文建立的细胞表面N-糖组DSA-FACE技术完成88对临床HCC组织样本细胞表面N-糖组分析。结果表明,与癌旁对照组相比,峰L10(NA3FB)在HCC细胞表面显著性增加(p0.0001),而峰L6(M8)在HCC细胞表面显著性降低(p0.0001)。这两个N-糖链在不同性别、年龄及癌细胞分化程度的患者中均表现出显著性改变,并于HCC发病早期就具有明显改变的趋势。此外,通过与具有不同组织来源及性别差异的100对乳腺癌组织细胞表面N-糖组的比较,NA3FB在两种不同的肿瘤细胞表面均具有显著性增高趋势,而NA2和M8的差异表达则具有明显的组织特异性。进一步通过分析61例HCC患者的临床组织样本及相应的血清样本N-糖组,发现,NA3FB不仅在HCC细胞表面显著性增高(p0.0001),而且在相应患者血清中的含量也显著增高(p0.0001)。这表明, HCC驻留型及分泌型糖蛋白NA3FB糖链修饰异常增多可能与HCC的发病机制具有相关性。 为探讨NA3FB显著增加的分子机理,本文对能够合成NA3FB的五种糖基转移酶(Fut8、GalT-1、GnT-V、GnT-IVa、GnT-IVb)在HCC临床组织中的表达进行了分析。结果表明,与相应癌旁组织相比,肿瘤组织中只有GnT-IVamRNA及蛋白的表达水平具有增高趋势。利用RNAi技术减低mgat4a表达48h后,检测HCC细胞系HepG2细胞表面NA3FB的表达水平。结果表明,与阴性对照相比,基因沉默组细胞表面NA3FB显著减少。这说明NA3FB的减少与糖基转移酶GnT-IVa的基因沉默直接相关。因此,该结果证实HCC细胞中GnT-IVa的异常高表达与细胞表面及血清中NA3FB异常增加密切相关。 综上所述,本文通过分析膜蛋白制备方法及引入GC树脂纯化方法,建立了适合于不同临床样本N-糖链的DSA-FACE检测技术,获得了适用于中国北方地区HCC早期诊断的血清糖链生物标志物,发现了HCC细胞表面异常增加的糖链NA3FB与GnT-IVa的异常高表达密切相关。由此,这种糖基化异常机理的初步分析为深入研究糖基转移酶与糖链结构异常、与HCC发生发展的关系提供了新的思路,对HCC早期诊断和潜在靶向治疗的靶点选择奠定了基础。


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