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哈茨木霉Rac基因的过表达及其功能初步分析

吕晨  
【摘要】:Rac基因属于小G蛋白中Rho超家族的成员,为信号转导途径相关基因。并且在许多丝状真菌当中起到很重要的作用。哈茨木霉属于木霉属,具有很强的生物防治作用,可以通过很多方式对植物病原菌起到很强烈的抑制作用。生物防治真菌行使生防功能过程也与信号通路相关,因此,对信号转导途径中的效应因子的研究将对揭示生物防治的机制有很大的贡献。 本实验旨在通过对Rac基因在哈茨木霉中进行过量表达,对Rac基因在哈茨木霉T88菌株的生长过程起到的作用进行初步分析。首先通过设计一对含有NcoⅠ和BstEⅡ酶切位点的引物,用PCR的方法从哈茨木霉基因组中扩增Rac基因,再通过酶切,连接的方法将Rac基因连接到表达载体pCAMBIA-1301的强启动子CaMV35S后,成功构建过量表达载体pCAMBIA-1301:rac。通过电转化的方法将表达载体转化进农杆菌GV3101中,通过农杆菌转化子与哈茨木霉菌株在液体诱导培养基中共培养,将载体转化进入哈茨木霉中,经初步的含有潮霉素浓度为50μg/mL的平板筛选,共得到60株哈茨木霉Rac基因过量表达转化子。选取5株转化子进行PCR和实时定量PCR鉴定,证实其中四株为Rac基因过量表达的转化子。 选取其中一株转化子测定其生长速率和产生分生孢子的情况,结果发现转化子的生长速率与野生型相比没有明显变化,但是产孢的速度比野生型快约24h,并且分生孢子的产量约为野生型的1.7倍。在与植物病原菌核盘菌和西红柿镰刀菌进行对峙实验中,显示转化子与野生型菌株均对两种病原菌有强烈的抑制作用,野生型对核盘菌的抑菌率为59.84%,转化子对核盘菌抑菌率为65.06%,野生型对西红柿镰刀菌的抑菌率为62.67%,转化子对西红柿镰刀菌的抑菌率66.49%。在对转化子菌丝形态进行显微观察时,发现Rac基因的过量表达对菌丝形态没有明显影响。对转化子酶活进行测定,发现转化子的纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、β-1,3-葡聚糖酶酶活均有所提高。


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