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球毛壳菌聚酮合酶基因的沉默对CheA合成的影响

刘郁涛  
【摘要】:真菌是一类可以合成大量不同化学结构和生物活性的次级代谢产物的一类微生物。真菌的代谢产物在新药研究和植物保护中有着重要的作用。毛壳菌属(Chaetomium spp.)在真菌家族中就是一个很典型的例子。本实验以球毛壳菌W7(Chaetomium globosum W7)作为研究对象,通过真菌RNAi的手段,研究了聚酮合酶基因在球毛壳菌素A(chaetoglobosins A,Che A)的生物合成过程中的作用。首先,对球毛壳菌基因组进行分析,找到了聚酮合酶基因的保守序列区,根据保守序列信息,构建了一个用于沉默球毛壳菌聚酮合酶基因的沉默质粒p S-pks。通过原生质体转化的方法得到了22株转化子,根据转化子表型的不同将它们分为三类,(1)第一类:0、9、10、11、12、16号转化子;(2)第二类:△1、△2、△3、△5、△6、△7、3、5、18、25、27、28、29号转化子;(3)第三类:△4、15、31转化子。最终选择0、△7、31号转化子进行后续实验。之后,对球毛壳菌素A的萃取及检测进行了优化,最终确定以丙酮作为萃取剂对萃取固体发酵平板进行萃取,HPLC的最优条件为:流动相为乙腈:水=45:55;检测波长为227 nm;检测时间为40 min。在该条件下,出峰时间为20 min的峰为目标产物,并且杂峰干扰较少。最后,对转化子的特性进行研究。(1)检测三株转化子和野生型之间pks基因表达量的差异。结果表明:三株转化子的pks基因均有不同程度的下调,三株转化子分别下调了68%、49%、92%;(2)对转化子及野生型的发酵粗提物进行检测,三株转化子Che A的产量分别为2.57μg/m L、3.62μg/m L、0μg/m L,而野生型的Che A产量为57.08μg/m L;(3)进行转化子及野生型对立枯丝核菌(Rhizoctonia solan)的对峙实验,实验结果表明:pks基因下调且Che A产量下降的转化子在抑菌能力上有着不同程度的降低,说明Che A的产量对于球毛壳菌在抑制病原生长的过程中的重要作用。本文证明了聚酮合酶基因在球毛壳菌的生长过程中,对其重要的次级代谢产物Che A的合成具有重要的影响,同时对病原菌的抑制也起着重要的作用。


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1 刘郁涛;球毛壳菌聚酮合酶基因的沉默对CheA合成的影响[D];哈尔滨工业大学;2015年
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