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基于LC-MS的肝癌血清及组织代谢组学研究

陆欣  
【摘要】:肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,具有发病隐匿的特点,被诊断时往往已经到了中晚期,治疗的预后效果较差。因此,肝癌的早期诊断及病情程度判定对于该病的防治及预后具有重要的临床意义。而代谢组学作为系统生物学的新兴方向,其主要是基于高灵敏、高通量的分析手段对生物体受扰动后的内源性小分子代谢产物的整体变化轮廓进行表征,具有灵敏、系统、动态的研究特点。为此,本研究应用液相色谱-质谱联用技术(liquid chromatography coupled to mass spectrometry,LC-MS)对肝癌血清及组织样本采集代谢轮廓数据,并利用单变量及多变量分析方法获得稳定可靠的血清诊断性代谢产物。在此基础上,利用代谢通路及网络分析结合细胞及分子生物学技术对相关机制进行初步探究。研究首先利用LC-MS技术分析获得299例肝癌及320例对照组血清代谢轮廓的高通量数据,利用主成分分析(principal components analysis,PCA)、偏最小二乘-判别分析(partial least square discriminant analysis,PLS-DA)模型分析了肝癌及对照组间的代谢轮廓。通过轮廓比对分析得出两组代谢组学数据存在差异,PCA结果显示检测结果的稳定性,PLS-DA分析结果显示两组具有显著性差异,进而利用随机森林法获得87个组间差异性代谢产物。在外部验证数据集中,利用Logistic回归、Pearson相关性分析及受试者工作曲线(receiver operating characteristic,ROC)筛选得到D-半乳糖等可用于诊断的代谢标志物。这些标志物与甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)联合诊断的灵敏度、特异度及单变量曲线下面积(area under the curve,AUC)分别为0.96、0.92、0.98,且将联合指标用于样本集中AFP阴性样本的预测,可以达到准确率78%,这一结果大大提高了AFP的诊断效能。而对于58例TNM I期样本,以上物质联合诊断的单变量AUC也可以达到0.96,提示其对于早期肝癌也具有较好的判定效果。此外,结合型胆酸具有一定的分期相关的变化趋势,呈现出一定的早期诊断潜能。进一步针对87个差异性代谢产物开展了代谢通路分析及网络分析,发现脂酰肉碱呈现出侧链长度及不饱和度的聚簇及递变规律,为相关机制研究提供参考。为了探讨血清中差异性代谢产物与肝癌组织中差异性代谢物的关系,本研究还展开了肝癌组织代谢轮廓分析。研究首先建立了基于LC-MS的肝癌代谢组学样本处理及分析方法,并获得80对肝癌及癌旁组织极性组分的代谢轮廓。PLS-DA模型表明肝癌及癌旁组织极性代谢轮廓具有显著差异。进一步利用正交隐变量投影-判别分析(orthogonal projection to latent structures discriminant analysis,OPLS-DA)模型获得29个可以表征肝癌及癌旁组织间差异的极性差异性代谢产物。通过血清与组织极性代谢轮廓的对比,发现了4个血清-组织共有差异性代谢产物:C14脂酰肉碱、L-酪氨酸、溶血性卵磷脂Lyso PC(18:2)及L-谷氨酸盐,并发现其在组织及血清中的变化趋势均相同。此外,结合型胆酸被发现在组织中的变化趋势与血清中相反且具有显著性相关,提示血清中结合型胆酸的变化可能源于肝癌组织。结合上述研究分析发现,肝癌样本的中短链脂酰肉碱降低及长链脂酰肉碱升高的趋势在血清及组织极性代谢轮廓存在一致性改变。为进一步系统探究该趋势的变化规律及相关机制,本研究利用代谢靶标分析方法考察了80对肝癌及癌旁组织中不同类型的26个脂酰肉碱的变化趋势,并结合定量逆转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)等分子生物学技术表征和验证了肝癌组织细胞中介导脂酰肉碱合成及分解的肉毒碱棕榈酰转移酶(carnitine palmitoyltransferase,CPT)的表达。结果显示,CPT1A在肝癌及癌旁组织间的m RNA表达没有区别,而CPT2在肝癌组织中的m RNA及蛋白的表达均显著低于癌旁组织,提示CPT2酶的表达降低是导致不同长度脂酰肉碱相对变化的诱因之一。为此,本研究构建了BEL-7402/CPT2-knockdown细胞株,并利用代谢靶标分析发现相对于阴性对照细胞,CPT2-knockdown细胞株中的中短链脂酰肉碱降低且长链脂酰肉碱升高,该趋势与组织中的脂酰肉碱变化趋势一致。以上结果表明CPT2的表达降低是导致不同长度脂酰肉碱相对变化的诱因之一。除对肝癌组织极性组分代谢轮廓开展分析之外,本研究进一步优化脂质组学分析方法,系统地表征了肝癌组织脂质代谢轮廓的变化及其规律。研究利用优化后的LC-MS技术获得高通量肝癌脂质组数据,应用PLS-DA模型考察了肝癌及癌旁组织整体及不同类型脂质代谢轮廓的差异,并最终鉴定了113个差异性脂质分子。随后,利用代谢拓扑分析筛选变化显著的脂质代谢通路,结果发现甘油磷脂代谢、甘油脂质代谢及鞘脂代谢三个通路呈现出显著性改变,其变量(差异代谢物)在通路中具有重要调控意义(Impact大于0.1),覆盖率p值小于0.05。此结果提示,这三个通路中的代谢酶在肝癌组织中呈现出显著性变化。进一步结果显示,磷脂酰乙醇胺及磷脂酰丝氨酸在肝癌组织中分别呈现降低及升高的趋势,与甘油磷脂代谢通路中介导二者转化的磷脂酰丝氨酸合成酶2(phosphatidylserine synthase 2,PTDSS2)在肝癌中的m RNA表达升高相符。同理,甘油三酯的降低与甘油二酯的升高也与脂蛋白酯酶(lipoprteinlipase,LPL)的表达及酶活性的升高相符,表明了上述代谢通路中确实存在代谢酶的改变,同时也提示LPL的表达升高是导致甘油二酯(diacylglycerol,DG)与甘油三酯(triacylglycerol,TG)转化失衡的原因。而DG则是磷磷脂酰肌醇细胞信号通路中的关键分子,被定义为第二信使,在肿瘤细胞信号转导中具有重要的意义。综上所述,本文利用代谢组学的研究策略筛选了具有较好临床诊断效能的潜在血清代谢标志物;同时还基于组织代谢组学技术平台,结合细胞及分子生物学手段初步探讨了肝癌组织脂酰肉碱相关变化的机制;并利用脂质组学策略结合代谢通路及拓扑分析探究了肝癌组织脂质代谢轮廓及相关通路的变化规律。因此,本研究为肝癌的临床诊断及相关病理机制研究提供价值信息。


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